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ARTÍCULO
ORIGINAL
Biotecnología Vegetal Vol. 12, No. 3: 179 - 182 , julio - septiembre,
2012
ISSN 2074-8647, RNPS: 2154 (Versión electrónica)
ISSN 1609-1841, RNPS: 0397 (Versión impresa)
Actividad antifúngica in vitro de bacterias frente a Mycosphaerella fijiensis mediada por metabolitos difundidos y volátiles
In vitro antifungal activity of bacteria against Mycosphaerella fijiensis mediated by diffused and volatile metabolites
Mileidy Cruz-Martín1*, Mayra Acosta-Suárez1, Ivian Poveda2, Michel Leiva-Mora1, Berkis Roque1, Yelenys Alvarado-Capó1.
1Instituto
de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las
Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba.
CP 54 830. e-mail: mileidy@ibp.co.cu
2Facultad
de Ciencias Agropecuarias. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera
a Camajuaní km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830.
RESUMEN
Los microorganismos antagonistas no tienen un único modo de acción y la multiplicidad de estos es una característica importante para su selección como agentes de control biológico. La Sigatoka negra se considera la enfermedad foliar de mayor impacto económico para la industria de banano en el mundo y para su control se requieren de nuevas estrategias que permitan disminuir el uso de fungicidas. Esto ha propiciado un aumento en el interés de encontrar alternativas biológicas como el empleo de bacterias antagonistas. En este trabajo se realizaron ensayos con el objetivo de determinar si la actividad antifúngica in vitro de 20 cepas bacterianas contra Mycosphaerella fijiensis era ocasionada por metabolitos difundidos al medio de cultivo o volátiles. Como resultado se constató que el 80.0% de las cepas bacterianas evaluadas mostraron actividad antifúngica in vitro por metabolitos difundidos al medio de cultivo así como el 60.0% mediante la producción metabolitos volátiles. El 55.0% de las cepas mostraron ambos mecanismos. Esta característica, hace de estas bacterias, mejores candidatos para su selección como agentes de control biológico.
Palabras clave: antagonistas, biocontrol, compuestos volátiles, metabolitos difundidos.
ABSTRACT
Antagonistic microorganisms do not have a unique mode of action. Multiplicity of these is an important feature for selection as biological control agents. Black Sigatoka is considered the foliar disease with most economic impact for the banana industry worldwide. New strategies to control it are required to reduce the use of fungicides. That is why an increasing interest to find biological alternatives, such as the use of antagonistic bacteria, has risen. Assays were carried out to determine whether in vitro antifungal activity of 20 bacterial strains against Mycosphaerella fijiensis was caused by metabolites diffused into the culture medium or volatile. Results demonstrated that 80.0% of bacterial strains tested showed in vitro antifungal activity by diffused metabolites in the culture medium and 60.0% by producing volatile metabolites. The 55.0% of strains showed both mechanisms. This feature makes these bacteria the best candidate for its selection as biological control agent.
Keywords: antagonistic, biocontrol, volatile compounds, diffused metabolites.
INTRODUCCIÓN
El control de hongos fitopatógenos mediante el empleo de otros microorganismos con efecto antagonista es una práctica mundial y la búsqueda de aislados más efectivos en el control biológico es un tema que ocupa a muchos investigadores.
En la naturaleza,
muchos microorganismos poseen actividad antifúngica en función
de su supervivencia, nutrición u ocupación de
un nicho ecológico determinado. Esta puede ser debido a la producción
de un variado grupo de sustancias y varios mecanismos pueden operar simultáneamente
bajo condiciones ambientales diferentes (Islam et al., 2012).
Los antagonistas no tienen un único modo de acción y la multiplicidad de estos es una característica importante para su selección como agentes de control biológico. El conocer los mecanismos implicados en la actividad antifúngica es crucial para el éxito en el uso de un agente de control biológico.
La Sigatoka negra, causada por el hongo ascomycete Mycosphaerella fijiensis Morelet, se considera la enfermedad foliar de mayor impacto económico para la industria de banano en el mundo. Según Churchill (2011) se requieren grandes avances en el desarrollo de nuevos sistemas de manejo integrado de la enfermedad para favorecer el incremento de la calidad y sanidad del cultivo, así como, disminuir el uso de fungicidas. Además, el incremento a nivel mundial de las demandas por las medidas de seguridad ha propiciado un aumento en el interés de encontrar alternativas biológicas para el control de la enfermedad. Los esfuerzos en este sentido se han encaminado fundamentalmente a la identificación de bacterias capaces de contribuir a las estrategias de control (Marín et al., 2003). No obstante, el conocer los mecanismos involucrados en la actividad antifúngica de las bacterias frente a este patógeno es importante para el establecimiento de estrategias efectivas. Es por ello que en este trabajo se realizaron ensayos con el objetivo de determinar si la actividad antifúngica in vitro frente a Mycosphaerella fijiensis de cepas bacterianas aisladas de la filosfera de Musa spp. era ocasionada por metabolitos difundidos al medio de cultivo o volátiles.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para el estudio se emplearon 20 cepas bacterianas pertenecientes a la Colección de Cultivos Microbianos del IBP. Estas fueron aisladas de la filosfera de Musa spp. y se seleccionaron previamente por poseer actividad antifúngica in vitro frente a M. fijiensis (Poveda et al., 2010).
El aislado de M. fijiensis empleado en todos los ensayos fue el CCIBP-Pf-83 perteneciente a la Colección de Cultivos Microbianos del Laboratorio de Microbiología Aplicada del IBP. Para su cultivo el aislado fue inoculado en Enlermeyers de 100 ml de volumen con 50 ml de medio de cultivo Caldo Papa Dextrosa (PDB) (BioCen) e incubado en agitación a 120 rpm y 28oC, durante 15 días.
Para determinar
si la inhibición del crecimiento del patógeno era ocasionada por
la producción
de metabolitos difundidos o volátiles por las cepas bacterianas, se siguieron
los protocolos propuestos por Montealegre et al. (2003) con algunas modificaciones.
Inhibición por metabolitos difundidos
La suspensiones bacterianas fueron crecidas durante 24 h en Caldo Nutriente (CN) (BioCen) y se ajustaron a DO600=0.1 (~ 5.0x109 ufcml-1).
En una placa de Petri (150 mm de diámetro) se añadió medio de cultivo PDA mezclado con una suspensión micelial de M. fijiensis (5.0x105 fragmentos de micelio/ml-1). Las placas se incubaron a 28ºC y oscuridad durante 24 h. Pasado este tiempo, se colocó un filtro de acetato de celulosa (Sartorius) de 0.22 µm encima del medio de cultivo. Sobre su superficie se depositaron las suspensiones bacterianas (3.0 µl por cepa) separadas por al menos 2.0 cm. Las placas se incubaron durante 48 horas más a 28 ºC y oscuridad.
Como control negativo se depositaron 3.0 µl de agua desionizada estéril en lugar de la suspensión bacteriana y como control del crecimiento bacteriano se empleó el mismo método, sin utilizar membrana. Se realizaron dos réplicas con dos repeticiones para cada cepa bacteriana. Se clasificaron como positivas las cepas bacterianas que produjeron halo de inhibición del crecimiento del patógeno.
Inhibición por metabolitos volátiles
En una tapa de una placa de Petri de 50 mm de diámetro se añadió medio de cultivo Agar Nutriente (BioCen), en la tapa de otra placa de Petri se añadió medio de cultivo PDA con una suspensión micelial de M. fijiensis (5.0x105 fragmentos de micelio/ml-1). Luego se inocularon 50 µl de suspensión bacteriana sobre el medio de cultivo Agar Nutriente.
Cuando la humedad del inóculo fue absorbida completamente, se colocaron las dos tapas una frente a la otra y se sellaron con Parafilm®. Como control se emplearon 50 µl de agua desionizada estéril en lugar de la suspensión bacteriana. Las placas se incubaron a 28oC durante 48 horas.
Pasado el tiempo de incubación se observó el crecimiento de M. fijiensis y se comparó con el control en ausencia de la suspensión bacteriana. Se dieron como positivas aquellas cepas en las que se inhibió el crecimiento del patógeno o su crecimiento fue menor que el control y como negativas en las que no se observó inhibición del crecimiento fúngico. Además, se realizaron observaciones microscópicas de las hifas del patógeno en los casos que se observó inhibición del crecimiento.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Inhibición por metabolitos difundidos
Como resultado de este experimento, se logró determinar que la inhibición del crecimiento del patógeno era ocasionada por la producción de metabolitos antifúngicos difundidos en el 80.0% las cepas. El método empleado resultó efectivo para caracterizar la actividad antifúngica de las 20 cepas evaluadas frente a M. fijiensis.
Mediante este método no existió contacto físico entre las cepas bacterianas analizadas y el micelio fúngico, por lo que en los casos en que se observaron halos de inhibición se sugiere la presencia y excreción de metabolitos antimicrobianos por la bacteria. Estos resultados coinciden con los informados por Montealegre et al. (2003) al evaluar cepas de Bacillus subtilis y B. lentimorbus frente a Rhizoctonia solani 618.
Además, Rhaman et al. (2007) con este método, demostraron que el crecimiento de Colletotrichum gloeosporoides fue completamente inhibido por sustancias difundidas por Burkholderia cepacia y Pseudomonas aeruginosa después de siete días de incubación.
El daño causado por los metabolitos bacterianos en el micelio fue comprobado microscópicamente. Estos estudios revelaron la presencia de hifas de aspecto anormal con deformaciones en sus extremos. Deformaciones similares se han referido en observaciones microscópicas de antagonismo de cepas de Bacillus subtilis frente a Fusarium graminearum. Estos cambios se atribuyeron a que probablemente los metabolitos antifúngicos actuaron en la membrana celular del hongo y alteraron su permeabilidad (Chan et al., 2003).
En este mismo patosistema, Riveros et al. (2003) demostraron claras alteraciones de las estructuras de Mycosphaerella fijiensis por tratamiento con los filtrados de los cultivos líquidos de cepas de Bacillus sp. y Serratia sp. aisladas de la filosfera de Lycopersicum esculentum (tomate) y banano.
De igual forma, Senthilkumar et al. (2007) como resultado del tratamiento de Rhizoctonia bataticola con Paenibacillus sp. cepa HKA-15, observaron deformaciones del micelio del patógeno y atribuyeron los daños observados a metabolitos de naturaleza peptídica.
Inhibición por metabolitos volátiles
Se comprobó
que la inhibición del crecimiento del patógeno fue ocasionada
también por la producción de metabolitos volátiles en el
60.0% de las cepas. El método empleado resultó efectivo para evaluar
la inhibición del crecimiento de M. fijiensis por la producción
de metabolitos volátiles (Figura 1).
El estudio de metabolitos volátiles para el control de patógenos fúngicos ha sido referido por varios autores (Chen et al., 2008, El-Hasan et al., 2009) aunque su aplicación práctica se ha visto relegada por lo complejo de la caracterización y purificación de este tipo de metabolito. Además, se requieren estudios relacionados con la formulación de productos a partir de cepas que tengan este mecanismo (Ting et al., 2010).
En el estudio microscópico se observaron deformaciones de las hifas y encrespamientos. Similares resultados fueron informados por Fiddaman y Rossal (1993) que observaron deformación y además vacuolización de las hifas en Rhizoctonia solani y Pythium ultimun como consecuencia del tratamiento con B. subtilis. Esta cepa secretó un metabolito volátil con propiedades fungicidas.
De las 20 cepas evaluadas, 11 presentaron los dos mecanismos de acción (55.0%) y dos ninguno de ellos. Esto coincide con resultados referidos por diferentes autores como Islam et al. (2012) quienes han determinado que varios mecanismos de acción pueden operar simultáneamente o la manifestación de un mecanismo u otro puede estar en correspondencia con las condiciones ambientales.
Estos resultados pudieran constituir un criterio importante a tener en cuenta para la selección de estas bacterias como agentes de control biológico, ya que, la multiplicidad de estos mecanismos es importante para el reforzamiento de las propiedades antifúngicas y una mejor eficiencia en el control.
REFERENCIAS
Chan, YK, McCormick WA, Seifert KA (2003) Characterization of an antifungal soil bacterium and its antagonistic activities against Fusarium species. Can.J. Microbiol. 49: 253-262
Chen, H, Xiao X, Wang J, Wu L, Zheng Z, Yu Z (2008) Antagonistic effects of volatiles generated by Bacillus subtilis on spore germination and hyphal growth of the plant pathogen, Botrytis cinerea. Biotechnol. Lett. 30: 919-923
Churchill, A (2011) Mycosphaerella fijiensis, the black leaf streak pathogen of banana: progress towards understanding pathogen biology and detection, disease development, and the challenges of control. Molecular Plant Pathology 14(2): 307-328
El-Hasan, A, Walker F, Schöne J, Buchenauer H (2009) Detection of viridiofungin A and other antifungal metabolites excreted by Trichoderma harzanium active against different plant pathogens. Eur. J. Plant Pathol. 124: 457-470
Fiddaman, PJ, Rossal S (1993) The production of antifungal volatiles by Bacillus subtilis. J. Appl. Bacteriol. 74: 119-126
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Marín, D, Romero R, Guzmán M, Sutton T (2003) Black Sigatoka: An increasing threat to banana cultivation. Plant disease 87(3): 208-222
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Poveda, I, M Cruz-Martín, C Sánchez-García, M Acosta-Suárez, M Leiva-Mora, B Roque, Y Alvarado-Capó (2010) Caracterización de cepas bacterianas aisladas de la filosfera de Musa spp. con actividad antifúngica in vitro frente a Mycosphaerella fijiensis. Biotecnología Vegetal 10 (1): 57-61
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Riveros, A, Giraldo, C, Gamboa, A (2003) Microbial control of Black leaf streak disease. En: Jacome, L, Lepoivre, P, Marín, D, Ortiz, R, Romero, R, Escalant, V (eds.) Mycosphaerella leaf spot disease of bananas, present status and Outlook. Proceeding of the Workshop on Mycosphaerella leaf spot disease held in San José, Costa Rica, pp. 287-298. INIBAP, Montpellier
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Recibido: 24-4-2012
Aceptado: 26-6-2012
Mileidy Cruz-Martín.Instituto
de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las
Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba.
CP 54 830. e-mail: mileidy@ibp.co.cu
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