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Artículo original
Biotecnología
Vegetal Vol. 12, No. 4: 211 - 219, octubre - diciembre, 2012
IISSN 2074-8647,
RNPS: 2154 (Versión electrónica)
ISSN 1609-1841,
RNPS: 0397 (Versión impresa)
Diversidad genética en cultivares de Manihot esculenta Crantz en Nicaragua determinada mediante microsatélites (SSR)
Genetic diversity of Manihot esculenta Crantz cultivars in Nicaragua assessed with microsatellite (SSR)
Erwin Aragon1*, Víctor Aguilar2, Jecsa Arguello3. *Autor para correspondencia.
1Instituto
Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria. Colonia Centroamérica,
Contiguo al Distrito 5, Policía Nacional-Apartado Postal 1247, Managua,
Nicaragua. e-mail: earagon17@hotmail.com
2Facultad
de Agronomía, Universidad Nacional Agraria. Managua Nicaragua, km 12
½ carretera Norte. Apdo 453.
3Egresada
de la carrera de Ingeniería Agronómica generalista, Facultad de
Agronomía, Universidad Nacional Agraria.
RESUMEN
Un total de 37 cultivares de yuca, colectados en cuatro departamentos de Nicaragua, fueron investigados mediante microsatélites, para revelar la diversidad genética y evaluar las relaciones filogenéticas con cultivares mejorados, con perspectiva a garantizar un manejo sostenible de los recursos genéticos que dispone el país. Los análisis de diversidad y diferenciación genética fueron desarrollados a partir de los datos obtenidos de nueve marcadores microsatelitales (SSR). Se detectó un total de 47 alelos y el número de alelos por locus varió de tres a nueve. Se encontró un alto índice de diversidad genética con 0.61. El valor promedio del Coeficiente de Información Polimórfica fue de 0.60. Esto demostró que los marcadores más informativos y polimórficos fueron GA-131, SSRY 100 y GA-12. El análisis molecular de varianza mostró una mayor diferencia dentro del grupo, no así entre grupos. La mayor distancia genética, se encontró entre el grupo de Matagalpa con el de Río San Juan, con menor distancia la Región Autónoma del Atlántico Sur con las Internacionales, mientras que el grupo de Río San Juan y León, presentaron la mayor identidad genética. El Análisis de Componentes Principales permitió identificar duplicidad dentro de las accesiones colectadas.
Palabras clave: accesiones, alelos, locus, yuca.
ABSTRACT
A total of 37 cassava cultivars from Nicaragua were evaluated using microsatellite marker to reveal the genetic diversity and phylogenetic relationship with improved cultivars, aiming to ensure a sustainable management of genetic resources of the country. The genetic diversity analyses were obtained from data of nine microsatellite markers. A total of 47 alleles were detected. The number of alleles varied from a range of three to nine. The index of genetic diversity was high with 0.61. The average value of the mean PIC was 0.60, showing that the most informative and polymorphic markers were GA-131, SSRY-100 and GA 12. The variance molecular analysis showed major difference within groups and low difference among groups. The largest genetic distance, determined among groups was found between population of Matagalpa and Río San Juan cassava accessions. South Atlantic Autonomous Region and introduced accessions presented the shortest genetic distance. while the population of Río San Juan and Leon showed the highest genetic identity. Analysis of the main components showed difference and duplicity among individual into cassava accessions collected.
Key words: accession, alleles, cassava, locus.
INTRODUCCIÓN
Manihot esculenta Crantz (2n = 36), conocida como yuca, mandioca o cassava, es una planta perenne, monoica perteneciente a la familia Euphorbiaceae, originaria del Noroeste de Brasil. La yuca ocupa el cuarto lugar en el mundo como producto básico, después del arroz (Oryza sativa L.), el trigo (Triticum sativum Lam. = Triticum aestivum (L.)Thell) y el maíz (Zea mays L.). Es fuente de calorías y componente básico en la dieta de más de 1 000 millones de personas de escasos recursos económicos (Morrillo, 2009). En Nicaragua se estima un área de 31 389.75 hectáreas cultivadas (INIDE y MAGFOR, 2011) y aunque las variedades de yuca han sido cultivadas por mucho tiempo, no se conoce con exactitud su estructura genética en una zona y ni las posibles relaciones genéticas entre ellas en las zonas productoras. Por ello, se desconoce la diversidad genética que existe en el país.
Una herramienta biotecnológica que se utiliza para identificar diversidad genética y duplicidad de accesiones dentro de los bancos de germoplasma, son los marcadores moleculares basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas del inglés: Polimerase Chain Reaction) (Wilches, 2004).
El Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria (INTA), a partir del año 2010, conduce estudios de mejora y conservación genética en cultivos para garantizar su calidad nutricional, entre las cuales se encuentra la yuca. El presente estudio, se realizó con el objetivo de determinar la diversidad genética de cultivares de yuca de las principales zonas del país, y establecer relaciones filogenéticas con cultivares mejorados. Esto contribuirá a garantizar un manejo sostenible de los recursos genéticos que dispone Nicaragua.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se colectaron accesiones en cuatro departamentos de Nicaragua, durante los años 2010 y 2011. Estas fueron agrupadas según el lugar de colecta (León, Matagalpa, Región Autónoma del Atlántico Sur y Río San Juan). Además, para el estudio se incluyeron 14 accesiones introducidas del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y 4 accesiones introducidas de Brasil para un total de 52 accesiones, con el fin de comparar la estructura genética de las accesiones nacionales (Tabla 1).
Extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN)
De cada accesión, se seleccionaron dos hojas jóvenes. Se desinfectaron con alcohol al 70% (v/v) y se secaron a temperatura ambiente durante tres días. Luego se procedió a triturar las hojas en nitrógeno líquido. Para la extracción de ADN, se usó el protocolo de extracción con Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB) desarrollado por Doyle y Doyle (1990). Se tomó aproximadamente 1 cm2 de hoja de cada accesión. El ADN se resuspendió en 100 µl de solución tampón tipo EDTA-TRIS (TE) y se mantuvo a -20°C hasta su uso. Su calidad de extracción y la estimación de su concentración se determinó por electroforesis al 0.8%.
Todos los productos PCR obtenidos se visualizaron en geles de agarosa tipo Metaphor a una concentración de 4%. A las cámaras se les adicionaron 600 ml de solución tampón Tris-Boro-EDTA a una concentración de 1X, mezclado con 25 ìl de Bromuro de Etidio. El tamaño de los fragmentos fue calculado mediante la aproximación exponencial a partir de los datos generados por los microsatélites.
Diversidad genética
La estimación de la diversidad genética se hizo para los microsatélites y para los grupos de accesiones en estudio. Para ello, se utilizó el software GenAlex versión 6.2 (Peakall y Smouse, 2006). Se emplearon los siguientes estadísticos: número de alelos (Na), heterocigosidad observada (Hobs), heterocigosidad esperada (Hesp), contenido de información polimórfica (CIP), indice de Shannon (I) y frecuencia alélicas.
Diferenciación genética
La identidad genética (Di) y la distancia genética (D) se calcularon mediante el software POPGENE versión 3.2 (Yeh y Boyle, 1997).
Para cuantificar
la diferenciación genética, se utilizó el análisis
molecular de varianza que es un marco de referencia para la estimación
de estructura genética a partir de la información contenida en
la frecuencia alélica, mediante el software GenAlex ver. 6.1
(Weir y Cockerham, 1984; Excoffier et al., 2005; Peakall y Smouse, 2006).
Para apoyar la determinación de los grupos de diversidad y duplicidad, se efectuó un análisis de componentes principales basado en la correlación simple entre los estimados de distancias genéticas, para ello se utilizó el software GenAlex versión 6.2 (Peakall y Smouse, 2006).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Diversidad genética
Un total de 47 alelos fueron encontrados usando nueve microsatélites, los que mostraron alto nivel de polimorfismo y ello coincidió con lo referido por Casalla (2003) y Chavarriaga-Aguirre et al. (1998) en otros estudios. El número de alelos amplificados por locus presentó valores entre tres y nueve (Tabla 3). El GA-140 y el GA-134 identificaron el menor número de alelos con tres, seguido del locus GA-5, GA-21 y GA-126 con cuatro alelos. Los locus que identificaron mayor número de alelos fueron el GA-131 con nueve, el SSRY 100 con ocho y el GA-12 con siete.
Para los grupos de accesiones estudiados, los microsatélites presentaron números de alelos comprendidos entre 1.78 y 4.56 para el número de individuos analizados (Tabla 4). El grupo de las accesiones de la Región Autónoma del Atlántico Sur (RAAS) alcanzó el mayor número de alelos con un valor de 4.56 mientras que el grupo de Matagalpa mostró el más bajo (1.78). El menor o mayor número de alelos encontrados pudiera estar influenciado por la cantidad de muestras analizadas en los respectivos grupos (Zaldívar y Rocha, 2006).
Las diferentes accesiones analizadas por locus, presentaron baja heterocigosidad observada (Hobs), con promedio de 0.15, (0.00 a 0.40) (Tabla 3), valores ya encontrados en otros estudios utilizando estos marcadores (Chavarriaga-Aguirre et al., 1998). Esto confirma que la yuca por naturaleza es heterocigoto y que la forma de reproducción influye en los niveles de heterocigosidad.
Por otra parte, la heterocigosidad esperada (Hesp) tuvo un valor promedio de 0.61 en el orden de los obtenidos por Chavarriaga-Aguirre et al. (1998), quienes refirieron promedios de Hobs de 0.265 y Hesp de 0.684.
El mayor valor Hesp (0.82) fue obtenido con el microsatélite GA-131 y el menor con GA-134 (0.31). Estas variaciones se deben a que cada marcador codifica una región específica del ADN de cada genotipo. La heterocigosidad observada con valor medio de 0.15 mostró variación de 0.11 a 0.19, mientras que la heterocigosidad esperada varió de 0.23 a 0.63, con valor medio de 0.48 (Tabla 4). La heterocigosidad se mantiene debido a que la heterosis es un fenómeno común en la yuca.
El mayor índice de heterocigosidad observada lo expresó el grupo de Matagalpa con 0.19 y el de la RAAS con 0.18, esto se atribuye a que la posible existencia de heterosis en los cultivares establecidos en las zonas, tienen ciertas implicaciones de selección por los productores, utilizando cultivares resultado de un mejoramiento genético, fundamentalmente en este cultivo, donde el principal atractivo es la raíz. Esto pudiera explicar que el valor de heterocigosidad de la RAAS sea casi igual a las accesiones del grupo de Matagalpa.
La finalidad de la producción de yuca en el departamento de la RAAS es para el comercio. Por ello, al momento de establecer las parcelas no hay selección del material vegetal con ancestro altamente productivo. Sin embargo, la producción de Matagalpa generalmente es utilizada para el autoconsumo, por lo que se considera que el productor antes de establecer la parcela selecciona un limitado número de plantas que presentaron mayor tamaño y mejor calidad de la raíz, así como mayor resistencia a plagas y enfermedades (Zaldívar y Rocha, 2006).
El índice de diversidad de Shannon para los marcadores mostró media de 0.87. El menor valor se correspondió con GA-134 (0.33) y el mayor GA-131 (1.41) (Tabla 3). Esto indicó la alta riqueza genética de los individuos analizados. Los marcadores GA-131 y SSRY-100 presentaron los valores más altos de efectividad y mayor diversidad de individuos en el locus. Por otra parte, el índice de diversidad de Shannon para los grupos de accesiones en estudio evidenció que la riqueza genética de los individuos del grupo de Matagalpa fue menor (0.38) en comparación con los grupos de la RAAS 1.11 e Internacionales 1.19, que fueron las de mayor tamaño (Tabla 4).
El Contenido de Información Polimórfica (CIP) estimado fue mayor de 0.5, lo cual indicó que los microsatélites fueron muy discriminativos con la información generada en los locus estudiados. El marcador GA-134 presentó el valor más bajo (0.30). El resto de los marcadores presentaron valores entre 0.46 y 0.81. Se destacó con el mayor valor de efectividad de información el marcador GA-131 (0.81). Los datos corroboraron que los microsatélites utilizados en el estudio son altamente polimórficos lo cual coincide con el criterio de Siqueira et al. (2009), quienes seleccionaron nueve marcadores altamente polimórficos, de los cuales siete fueron incluidos en el presente estudio.
Frecuencia alélica por grupo
El marcador molecular que identificó mayor número de alelos frecuentes fue el GA-131 con nueve, seguido de SSRY-100 y GA-12 con frecuencia de ocho y siete alelos, siendo los marcadores mas polimórficos, respectivamente. En los grupos que se identificaron mayores frecuencias alélicas fueron el de la RAAS, seguido del grupo de las accesiones Internacionales, Río San Juan y León. El grupo de Matagalpa presentó menor frecuencia alélica en todos los locus analizados, encontrando menor riqueza alélica.
Diferenciación genética
El Análisis molecular de varianza (AMOVA) permitió describir los componentes intra e inter grupo de la varianza (Tabla 5). Considerando los datos generados por los nueve SSR analizados, no se encontró diferencia entre los grupos. Esto se debe a que es una misma especie y a que los grupos colectados corresponden a una agrupación geográfica. Sin embargo, se encontró una variación dentro de los grupos de un 100%, debido a la diferencia entre individuos. Estos resultados coinciden con el estudio realizado por Beovides et al. (2006), donde encontraron baja diferenciación entre los grupos locales, que tienen origen y/o están emparentados con los materiales de yuca, de los centros internacionales de mejoramiento genético tales como CIAT que están vinculados a la región.
La mayor distancia genética se encontró en el grupo de Matagalpa comparado con el grupo de las accesiones Internacionales con 0.2165 (Tabla 6). Probablemente se deba a que las accesiones internacionales no están relacionadas con las accesiones existentes en Matagalpa. Esta región está ubicada en el centro del país y los agricultores se dedican más al cultivo de café (Coffea spp.), cacao (Theobroma cacao L.) entre otros y tiene menor importancia el cultivo de yuca. Esto reduce las probabilidades de que se hayan difundido accesiones a esta región.
La menor distancia genética se presentó entre el grupo de Río San Juan y el grupo de la RAAS con valor de 0.0859. Esto demuestra que las accesiones de estos dos departamentos están muy relacionadas entre sí, probablemente debido a que son departamentos vecinos, lo que facilita el intercambio de materiales vegetativos entre pequeños agricultores de la zona.
La menor identidad
genética se expresó entre el grupo de las accesiones Internacionales
y el de Matagalpa con valor de 0.8054. Esto
corrobora que a menor identidad existe mayor distancia genética entre
el grupo comparado. Los grupos con mayor identidad genética fueron el
de Río San Juan y el grupo de la RAAS con valor de 0.9177 (Tabla 6).
Análisis de componente principales (ACP)
El ACP permitió distinguir gráficamente la relación existente entre las accesiones, apoyado en la matriz de distancia genética de Nei (1972). Los componentes 1 y 2 explicaron la mayor variación con el 33.5% y 21%, respectivamente. Dada la distribución a nivel nacional de yuca mejorada, no se lograron distinguir grupos muy diferenciados, ya que existe una estrecha relación entre las accesiones nacionales y las introducidas, lo que puede estar vinculado al proceso de distribución de cultivares de yuca por los programas internacionales tales como CIAT.
Al mismo tiempo, permitió identificar duplicidad de accesiones. En este sentido se comprobó que BGNY027 y BGNY41 son idénticos, así mismo BGNY34 con BGNY45 y BGNY26 y BGNY35 (Figura 1).
CONCLUSIONES
Se demostró la existencia de variabilidad genética en las accesiones de yuca colectadas en los principales departamentos productores de yuca de Nicaragua. Además, se encontró duplicidad de accesiones. Estos resultados permitirán seleccionar materiales vegetales diferentes mediante el uso de marcadores específicos de mejoramiento genético.
REFERENCIAS
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Recibido: 15-6-2012
Aceptado: 8-10-2012
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