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Comunicación corta Biotecnología vegetal Vol. 3, No. 1: 49-52, 2003
Detección de contaminantes bacterianos y fúngicos endógenos en el establecimiento de Musa spp.
Daymí Carrazana García*1, Lidcay Herrera Isla1, Niurka Mollinedo Diego1, Norma Suárez Canino1, Idania Arboláez Moré2, Hermelinda Castellanos Morales2, Teresita Martínez García3. *Autor para correspondencia.
1Universidad Central Marta Abreu de Las Villas, Carretera a Camajuaní km 5 ½, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. e-mail: daymic@qf.uclv.edu.cu
2Biofábrica de Villa Clara, Carretera a Malezas km 1½, Santa Clara, Villa Clara, Cuba.
3Hospital Provincial Universitario Clínico Quirúrgico Arnaldo Milián Castro, Carretera a la Pollera y Circunvalación, Santa Clara, Villa Clara, Cuba.
RESUMEN
Se probó un método de fijación en formol al 10%, inclusión en parafina y realización de cortes histológicos teñidos diferencialmente de microcormo y raíz de plantas in vitro de Musa spp. para la detección de bacterias y hongos endógenos realizando inoculaciones de Erwinia chrysantemi E 84 y Fusarium oxysporum var cubense15 en cultivares susceptibles. El mejor resultado se obtuvo con la tinción de Safranina Verde brillante para las bacterias y el procedimiento de Schiff Acido peryódico para los hongos. Se establecieron 35 ápices caulinares de Musa spp. cv FHIA 18 colocándose una porción de tejido vegetal adyacente al explante en medios de cultivo microbiológicos. Una muestra similar se fijó en formol al 10%. A partir de los tubos de ensayo contaminados se aislaron cultivos puros de los microorganismos presentes y se utilizó el procedimiento de corte histológico y tinción diferencial para la determinación de endogenicidad. Se encontró un bacilo Gram positivo no formador de endospora y un coco Gram positivo agrupado en forma de sarcina, ambos endógenos. Un hongo de la clase Deuteromycetes resultó ser un contaminante endógeno y Fusarium sp. un contaminante probablemente introducido durante la preparación del explante.
Palabras clave: bacterias, hongos, microorganismos endógenos, micropropagación
ABSTRACT
A method consisted in fixation of microcorm and root of Musa spp. in formaldehyde 10%, inclusion in paraffin and histological cuts, stained differenciality to detect endogenous bacterial and fungal contaminants by inoculations of Erwinia chrysantemi E 84 and Fusarium oxysporum var cubense15 in susceptible cultivars. The bests results were obtained with the stain of Saphranine Brillant green for bacteria and the Schiff Peryodic acid for fungi. 35 meristems tips of FHIA-18 were established, being placed a portion of adjacent vegetal tissue to the explant in microbiological media. A similar probe was fixed in formaldehyde 10%. Several isolation were realized in order to obtain pure culture of the microorganisms detected. Histological and differential staining were used to determine the endogenous origin. A non esporogenous Gram positive rod and Gram positive coccus grouped like sarcine type were found. One fungus of class Deuteromycetes resulted a endogenous contaminant and Fusarium sp. introduced probability during the preparation process of the explant.
Key words: bacteria, fungus, microorganisms endogenous, micropropagation
INTRODUCCIÓN
La existencia de poblaciones de bacterias endógenas en los explantes constituye el factor responsable de las mayores pérdidas por contaminación microbiana en el cultivo in vitro de plantas. Las mismas pueden aparecer en cualquier etapa del proceso y su detección es difícil, pues la mayoría crecen muy poco en los medios de cultivo para plantas, manteniéndose latentes hasta que los mecanismos de resistencia de las plantas in vitro se debiliten o surjan cambios en el medio ambiente del frasco de cultivo que favorezcan su crecimiento visible. Los contaminantes fungosos crecen favorablemente en los medios de
cultivo para plantas pero existen pocas referencias de hongos endógenos (Leifert et al., 1994).
La escasa información sobre los contaminantes bacterianos y fúngicos presentes en el cultivo de tejidos vegetales de Musa spp. y la posibilidad de su asociación a este género vegetal estableciendo su carácter endógeno mediante la demostración de su presencia en el explante, fundamentan la realización de la investigación desarrollada. La misma tuvo como objetivos establecer un procedimiento histológico para la detección microscópica de bacterias y hongos endógenos y aislar contaminantes bacterianos y fúngicos en el establecimiento de Musa spp. especificando su carácter endógeno o ambiental.
MATERIALES Y MÉTODOS
Procedimiento histológico para la detección microscópica de bacterias y hongos endógenos
Se inocularon 10 plantas in vitro de Musa spp. cv Grande naine procedentes del Banco de Germoplasma del Instituto de Biotecnología de Las Plantas (IBP) mediante la inyección en el microcormo de 0.5 ml de una suspensión de 4.8 x 107 células de Erwinia chrysantemi E 84 procedente de la colección del Centro Nacional de Salud Agropecuaria (CENSA), sumergiéndose las mismas además de forma individual en 50 ml de la misma suspensión durante 30 minutos después de podarse las raíces. Se siguió igual procedimiento con dos plantas in vitro como control, utilizando agua destilada estéril. Las plantas fueron sembradas en sustrato estéril, suministrado por el IBP, constituido por un 80% de materia orgánica formada por cachaza y un 20% de zeolita cargada con nitrógeno, fósforo, potasio y microelementos. A partir de la aparición de amarillamiento de las hojas se tomó una planta cada 24 horas, se extrajo el microcormo y se seccionaron las raíces, fijándolos en formol al 10 % para su posterior inclusión en parafina mediante el empleo de un histoquinet (Warning). Se realizaron cortes histológicos de 5 a 10 mm empleando un micrótomo (MC2). Se probaron tres tinciones diferenciales: Método de Jensen (Pecocck, 1990), Solución verde claro y Safranina Verde brillante (González, 1990) para demostrar la presencia de bacterias en el interior del tejido vegetal.
Se inocularon 10 plantas in vitro de Musa spp. cv Gros Michel procedentes del Banco de Germoplasma del IBP a las que se podaron las raíces previamente, mediante su inmersión en 50 ml de una suspensión de 3 x 104 esporas de Fusarium oxysporum var cubense 15 procedente del Instituto de Investigaciones Fundamentales en Agricultura Tropical (INIFAT) y se siguió el procedimiento antes descrito. Se probó el método de tinción diferencial de Schiff Acido peryódico según Drings Hotchkiss (Pecocck, 1990).
Los cortes histológicos teñidos fueron observados en microscopio óptico de campo claro (Olympus Vanox) con aumento de 2000 x para la detección de bacterias y 400 x para la de hongos.
Aislamiento de contaminantes endógenos bacterianos y fúngicos en el establecimiento de Musa spp.
Se establecieron 35 ápices caulinares de Musa spp. cv FHIA 18 según el procedimiento indicado en el Instructivo Técnico del Plátano (Cuba, 1990). Durante la preparación de los explantes e inmediatamente antes de su colocación en el medio de cultivo para el establecimento, se tomaron dos porciones de tejido vegetal adyacentes al explante por debajo y encima del mismo, colocándose uno de ellos en un frasco con formol al 10 % y el otro en un tubo de ensayo de 15 x 2 cm que contenía un medio de cultivo microbiológico, el cual fue incubado en las mismas condiciones que el de establecimiento. Se emplearon cuatro medios de cultivo microbiológicos: Agar Triptona Soya (ATS) (BioCen), NB (fosfato de amonio: 1200 mg.l-1, hidrógeno fosfato de potasio:1200 mg.l-1, sulfato de magnesio: 480 mg.l-1, cloruro de sodio: 1200 mg.l-1, extracto de levadura: 2400 mg.l-1, glucosa: 24 000 mg.l-1, pH 7.0), Agar Levadura Peptona (PYA) (peptona: 5000 mg.l-1, extracto de levadura: 3000 mg.l-1, cloruro de calcio: 1300 mg.l-1, agar: 6000 mg.l-1, pH 6.8), MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con tiamina 1 mg.l-1, piridoxina 1 mg.l-1, ácido nicotínico 1 mg.l-1, mioinositol 100 mg.l-1, sacarosa 30 000 mg.l-1, bencilaminopurina 3 mg.l-1 y extracto de levadura 250 mg.l-1 y Agar Sabouraud (AS)(BioCen). En aquellos tubos donde se presentó contaminación microbiana visible se tomó una porción del medio de cultivo y se procedió a la obtención de cultivos puros por el método de diseminación en placas de Petri conteniendo ATS o AS según el caso, las cuales fueron incubadas a 30°C durante siete días. A las cepas fúngicas se les realizaron preparaciones húmedas de gota aplastada montadas con lactofenol azul para la observación de hifas y conidios, procediendo a su identificación preliminar según su morfología y características siguiendo criterios taxonómicos descritos por Nelson et al. (1981) y Barnett y Hunter (1986). A las cepas bacterianas se le realizaron extensiones fijadas y teñidas mediante tinción simple y de Gram, para la observación de forma, agrupación y respuesta al Gram.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Procedimiento histológico para la detección microscópica de bacterias y hongos endógenos
Los mejores resultados obtenidos para la realización de cortes histológicos y tinción diferencial para la detección de contaminantes bacterianos endógenos correspondieron a la tinción diferencial Safranina Verde brillante, la cual permite la observación, con excelente resolución, de las colonias bacterianas de color rojo y el tejido vegetal de color verde. Con el método de Schiff Acido peryódico se obtuvieron buenos resultados en la detección de hongos filamentosos endógenos. Mediante esta se pueden observar las hifas de color rojo y el tejido vegetal de color verde.
En la literatura consultada se refieren varios procedimientos para la demostración de endogenicidad microbiana en tejidos vegetales, desde los que emplean microscopía electrónica de barrido (Gunson y Spencer-Phillips, 1994), con los que se obtienen excelentes resultados, hasta aquellos donde se aplican varios métodos de tinción diferencial a cortes de tejidos fijados e incluidos en parafina. Entre
las tinciones empleadas para la detección de bacterias se pueden citar la de azul de toluidina, observándose las preparaciones en microscopio de fluorescencia (Surga y Guevara,1994), que posee el inconveniente de que requiere un período de 15 días para su ejecución y la de naranja de acridina, empleando microscopía de fluorescencia (Monier,1998). Para la observación de hifas y esporas fúngicas se ha empleado la tinción con azul de anilina, empleando microscopía de fluorescencia (Williamson et al., 1998). Los métodos que emplean microscopía de fluorescencia tienen el inconveniente de que las preparaciones deben ser observadas inmediatamente (como máximo en el término de 48 horas) y no pueden conservarse.
Las tinciones seleccionadas en esta investigación resultan relativamente sencillas y rápidas de realizar y las preparaciones montadas en bálsamo de Canadá pueden conservarse por largo tiempo.
En todas las preparaciones observadas no se conservó la integridad del tejido vegetal en los bordes de los cortes histológicos por lo que se recomienda realizar cortes entre 10 y 15 mm.
Detección de contaminantes endógenos bacterianos y fúngicos en el establecimiento de Musa spp.
De los 35 tubos con medio de cultivo MS para establecimiento se contabilizaron 10 con turbidez muy ligera en el transcurso del experimento. De estos, cuatro presentaron inhibición de la brotación que seguida de necrosis parcial y finalmente total del explante. Solamente en uno de ellos se comprobó la presencia de contaminantes microbianos luego del aislamiento en medios microbiológicos, tratándose en este caso de una bacteria Gram positiva en forma de bacilo, no formadora de endospora. En el corte histológico del tejido adyacente al explante se observaron colonias bacterianas agrupadas junto a las paredes celulares, lo cual indicó que se trataba de un contaminante bacteriano endógeno. Además del mismo tubo se aisló un hongo filamentoso, identificado como Fusarium sp.. En el corte histológico teñido no se observaron estructuras de este hongo, por lo que se infiere que es un contaminante introducido durante la preparación del explante, aunque no se excluye la posibilidad de que las hifas del hongo se hayan ubicado longitudinalmente en los haces vasculares, por lo que resulta conveniente en la futura aplicación de este método realizar cortes longitudinales a los tejidos vegetales fijados e incluidos en parafina. Fusarium spp. constituyó el 23% de los hongos filamentosos aislados a partir de tejidos vegetales que se mantuvieron libres de contaminantes microbianos durante más de 12 meses y el 18% de los contaminantes fúngicos aislados del aire de los laboratorios de cultivo de tejidos vegetales (Danby
et al., 1994). Herrera et al. (2001) aislaron contaminantes de este género a partir de la fase de multiplicación de Dioscorea alata, Manihot esculenta y Xanthosoma sagittaefolium.
En los tres tubos restantes no se obtuvo crecimiento en los medios de cultivo microbiológicos para el aislamiento, aunque pudieron estar presentes contaminantes microbianos con requerimientos nutricionales específicos no existentes en los medios de cultivo microbiológicos empleados.
En un tubo de ensayo con AS se detectó a las 96 horas de iniciado el experimento una colonia redondeada cuyo centro se localizaba en el borde del tejido vegetal. Luego del aislamiento se identificó un hongo perteneciente a la clase Deuteromycetes. En el corte histológico teñido se observaron hifas en el tejido vegetal, indicando su carácter endógeno.
En otro tubo de ensayo con ATS se detectó opacidad a los 12 días de iniciado el experimento, aislándose un coco Gram positivo agrupado en forma de sarcina. En el corte histológico teñido se observó un ácaro y colonias agrupadas a su alrededor, sin poder precisarse si este actuó o no como vector de los microorganismos endógenos.
CONCLUSIONES
Los procedimientos de fijación del tejido vegetal en formol al 10%, inclusión en parafina y realización de cortes histológicos teñidos con los métodos diferenciales de Safranina Verde brillante y Schiff Acido peryódico son apropiados para la detección de contaminantes bacterianos y fúngicos endógenos en el cultivo de tejidos vegetales de Musa spp. Se encontró un bacilo Gram positivo no formador de endospora y un coco Gram positivo agrupado en forma de sarcina, ambos endógenos. Fusarium sp. y un hongo de la clase Deureromycetes fueron contaminantes en la micropropagación de Musa spp. probablemente ambiental y endógeno respectivamente.
REFERENCIAS
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Cuba, Ministerio de la Agricultura. Instructivo Técnico del cultivo del Plátano (1990) Ciudad de La Habana: CIDA
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