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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 11, No. 2: 107 - 113, abril - junio, 2011
ISSN 1609-1841 (Versión impresa)
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Caracterización molecular de variedades de caña de azúcar cultivadas en el estado de Tabasco, México
Vianey González-Jiménez1, Apolonio Valdez Balero1, Fernando Carlos Gómez Merino2, Hilda Victoria Silva Rojas2, Julián Pérez Flores1, Carlos Fredy Ortiz García1. *Autor para correspondencia
1Colegio de Postgraduados, Campus Tabasco. Periférico Carlos A. Molina s/n, H. Cárdenas 86 500, Tabasco, México. e-mail: apoloniouvb@colpos.mx
2Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. Carretera México-Texcoco km 36.5 Montecillo 56 230 Estado de México
RESUMEN
El objetivo del presente trabajo fue caracterizar molecularmente la variabilidad genética en variedades de caña de azúcar (Saccharum spp.) cultivadas en el estado de Tabasco, México, mediante AFLP. Se utilizaron 12 variedades de caña de azúcar de las cuales se tomaron hojas jóvenes de plantas en campo. Después de realizar 12 combinaciones de cebadores, los resultados indicaron que la combinación E-ACC/M-CTA produjo fragmentos polimórficos de 72 a 1353 pb. El dendrograma reveló dos grupos distintos de Saccharum spp. y una variedad que se diferenció de ambos. El grupo I comprendió las variedades C 87-51, ATM 96-40, B 4362, Mex 69-290, Mex 57-1285 y Mex 91-130, que formaron un conglomerado y presentaron una similitud del 0.77%. El grupo II comprendió las variedades RD 75-11, Mex 79-431, SP 70-1284, Mex 59-32 y CP 72-2086 las cuales conformaron otro conglomerado con 0.70%. La variedad Mex 68-P-23 se diferenció de las otras 11 variedades.
Palabras clave: ADN, AFLP, marcadores moleculares
ABSTRACT
To characterize varieties in recent years have used different types of morphological, biochemical and molecular methods. The aim of this study was to characterize molecular genetic variability in varieties of sugarcane (Saccharum spp.) grown in the state of Tabasco, Mexico, by AFLP. It was used 12 varieties of sugarcane. Young leaves of plants growing in the field were selected for experiment. After making 12 combinations of primers, the results indicated that the combination E-ACC/M-CTA produced 72 to 1353 bp polymorphic fragments. The dendrogram revealed two distinct groups of Saccharum spp. and a variety that differed from both. Group I comprised the varieties C 87-51, 96-40 ATM, B 4362, 69-290 Mex, Mex Mex 91-130 and 57-1285, which formed a cluster and showed a similarity of 0.77%. Group II included the varieties RD 75-11, Mex 79-431, SP 70-1284, 72-2086 and CP Mex 59-32 which formed another cluster with 0.70%. The variety Mex 68-P-23 differed from the other 11 varieties.
Keywords: DNA, AFLP, molecular markers
INTRODUCCIÓN
El aumento en la producción mundial de azúcar se debe a la introducción de cultivares mejorados (Jackson, 2005). Los cultivares modernos de caña de azúcar (Saccharum spp.) plantados en el mundo resultaron del intercruzamientos a partir de la primera cruza interespecífica llevada a cabo al principio del siglo pasado, entre S. officinarum, S. spontaneum y S. barberi (Grivet y Arruda, 2002). En las últimas décadas diferentes autores han señalado la
necesidad de crear germoplasma nuevo que posea un mayor rendimiento de azúcar, alta resistencia a los factores abióticos y bióticos y que sea de fácil manejo agronómico (Lu et al., 1994, Baksha et al., 2002).
Saccharum officinarum es una especie octoploide con un número cromosómico 2n=70 a 140 (Irvine, 1999). Por tal razón, se piensa que los clones comerciales son el producto de numerosas hibridaciones con números cromosómicos elevados 2n = 100
a 130 debido a fenómenos de euploidía y aneuploidía (Grivet y Arruda, 2001). Por estas razones, la caracterización de las variedades de caña de azúcar es un aspecto importante en la generación de nuevas variedades.
Para la caracterización de variedades, en los últimos años se ha utilizado diferentes tipos de marcadores morfológicos, bioquímicas y moleculares. Los marcadores más utilizados para la caracterización de plantas son los bioquímicos y los marcadores basados en ácido desoxirribonucleico (ADN), entre los que se pueden citar: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP, del inglés: restriction fragment length polymorphism), Amplificación Aleatoria del ADN Polimórfico (RAPD, del inglés: Random Amplification of Polymorphic DNA), Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados, (AFLP, del inglés:Amplified Fragment Length Polymorphic) y Microsatélites o Secuencias Simples Repetidas (SSR, del inglés:Short Sequence Repeat).
Mediante la amplificación de ADN por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, del inglés Polimerase Chain Reaction) estos marcadores permiten la identificación y el aislamiento de genes de interés y se están utilizando en el trazado genético de la caña de azúcar (Hoarau et al., 2001; Rossi et al., 2003), así como en la deducción de inferencias
acerca de la variabilidad genética y las interrelaciones entre los genotipos a nivel de ADN (Lima et al., 2002; Cordeiro et al., 2003). Entre estos trabajos se destaca la construcción de mapas genéticos en variedades comerciales (Aitken et al., 2005).
Los marcadores moleculares tipo AFLP combinan las tecnologías de RFLP y de PCR. Esta técnica consiste en la amplificación de múltiples regiones arbitrarias del genoma (Vos et al., 1995). Además, se ha utilizado con éxito para la obtención de marcadores moleculares distribuidos en genomas de eucariontes, así como en plantas cultivadas que presentan una baja tasa de polimorfismo de ADN, ya que tienen la capacidad de amplificar un gran número de loci a lo largo del genoma. Además, se utilizan en la detección y evaluación de la variación genética en colecciones de germoplasma y el estudio de la biodiversidad (Vuylsteke et al., 2000). Por tal motivo esta técnica fue elegida para caracterizar molecularmente variedades de caña de azúcar del estado de Tabasco, México.
MATERIALES Y MÉTODOS
Variedades de caña de azúcar
Se utilizaron 12 variedades de caña de azúcar del banco de germoplasma ubicado en el campo experimental del Colegio de Postgraduados Campus Tabasco (Tabla 1).
Las muestras, para ser procesadas en el laboratorio, se tomaron de hojas jóvenes de plantas en campo de acuerdo con la metodología recomendada por el protocolo del laboratorio de genética molecular aplicada del Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT) (2006).
Extracción del ADN
Para la extracción del ADN se empleó el método descrito por Baindrige et al. (1990). Posteriormente, se determinó la concentración de ADN mediante la lectura por espectrometría. Se igualaron las concentraciones de todas las muestras a 100 ng μl-1. El procedimiento para la realización de los AFLPs, siguió las recomendaciones indicadas en el Kit AFLP®Analysis System I y AFLP® Starter Primer Kit (InvitrogenTM, Carlsbad, CA).
Digestión genómica del ADN
El ADN genómico fue digerido usando las enzimas de restricción EcoRI y MseI. Se hizo una mezcla de 5X de reacción Buffer (5 ì l), ADN control de tomate (100 ng en 5 ì l (2.5 ì l), muestra de ADN (250 ng en 18 ì l), EcoRI/MseI (2 ì l), agua destilada (15.5 ì l) para un volumen final de 25 ì l. Se encubó a 37°C por 2 h.
Ligación de adaptadores
Para la ligación se hizo una dilución 1:5, con 24 ì l de adaptadores solución de la ligación y 1 ì l de T4 ADN ligasa.
Pre-amplificación
La pre-amplificación se realizó con una dilución 1:10 de la mezcla Primer Mix (40 ì l), 10 X PCR buffer plus Mg (5.0 ì l), Taq ADN polimerasa (1 ì l). La solución resultante fue llevada a un termociclador ADN (Engine Peltier Thermal Cycler de Bio-Rad), previamente programado para 20 ciclos a 94 °C por 30 s, 56 °C por 1 min y 72 °C por 1 min. De la pre amplificación se prepararon diluciones 1:10 con agua para AFLP (Sigma).
Amplificación selectiva
De acuerdo con las recomendaciones del fabricante se buscaron posibles combinaciones para encontrar las que dieran mejor patrón de bandeo y así poder diferenciar las 12 variedades de caña de azúcar (Tabla 2).
Análisis de datos
A partir de los patrones electroforéticos obtenidos de las pruebas moleculares, se evaluaron las bandas de forma binaria considerando el valor 0 como ausencia y 1 como presencia. A partir de las matrices de los datos originales, se calculó el coeficiente de similitud genética entre cada par de genotipos, utilizando solo las bandas polimórficas, mediante el paquete estadístico NTSys PC 2.0 (dendrograma y matriz de distancias genéticas).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Como resultado de la evaluación de las 12 combinaciones de iniciadores se encontró que la combinación E-ACC/M-CTA fue la que mostró mayor polimorfismo entre variedades. El tamaño de los fragmentos polimórficos detectados con esta combinación de cebadores osciló desde 72 hasta 1353 pb (Figura 1).
El escaso polimorfismo detectado indica la estrecha base genética de las 12 variedades evaluadas cultivadas en el estado de Tabasco, México. Lo cual puede deberse a que el género Saccharum se caracteriza por una alta poliploidía y una aneuploidía frecuente (Grivet y Arruda, 2001). Además, la caña de azúcar tiene un genoma complejo que va de 2500 a 4000 millones de pares de bases (Mbp 1C) (Arumuganathan y Earle, 1991). Solo S. offcinarum tiene un genoma de ADN cloroplástico de 141182 pb (Asano et al., 2004; Calsa et al., 2004).
Otra razón del poco polimorfismo observado puede deberse a que los cruzamientos entre genotipos se enfocan principalmente a la generación de variedades con resistencia a plagas y enfermedades (Harvey el at., 1994).
Estos han sido exitosos y han originado variedades de caña de azúcar más productivas pero con una marcada reducción en su base genética (Jannoo et al., 1999).
La técnica de AFLP ha mostrado resultados exitosos en caña de azúcar en varios países. Estudios realizados en Brasil, con 79 cultivares detectaron un promedio de 50% de 52% de polimorfismo entre 28 cultivares, cuando utilizaron 12 combinaciones (Lima et al., 2002). En la India, se informó de un promedio de 52% de polimorfismo entre 28 cultivares, utilizando 12 combinaciones (Selvi et al., 2006).
Por otra parte, en México, Rodríguez et al. (2005) caracterizaron las 15 variedades más utilizadas en la producción de caña de azúcar, mediante 12 combinaciones de AFLP. Sus resultados generaron un total de 884 marcadores, de los cuales 55.3% fueron polimórficos. Las variedades Mex 73-523 y Mex 68-P-23 se ubicaron en las ramas más alejadas del dendrograma y aparecen como no unidas a otras variedades.
Igualmente, Raboin et al. (2008) hicieron un estudio en 72 clones de Saccharum spp. utilizando la técnica de AFLP. Estos autores encontraron 1.537 marcadores polimórficos con 42 combinaciones. De estos marcadores, solo 463 fueron localizados en el mapa genético.
El dendrograma reveló dos grupos distintos de Saccharum spp. y una variedad que se diferenció de ambos grupos (Figura 2). El grupo I comprendió las variedades C 87-51, ATM 96-40, B 4362, Mex 69-290, Mex 57-1285 y Mex 91-130, las cuales presentaron un 0.77% de similitud genética. Esto representa una mayor cercanía genética, entre variedades comparadas con las variedades del grupo II. El grupo II comprendió las variedades RD 75-11, Mex 79-431, SP 70-1284, Mex 59-32 y CP 72-2086, las cuales formaron un conglomerado con un 0.70% de similitud genética.
La variedad Mex 68-P-23, fue la que presentó una menor similitud genética con un 0.22% con el resto de las variedades analizadas.
Rodríguez et al. (2005), encontraron que genotipos de caña de azúcar constituyeron una población genéticamente estrecha y que
la variedad Mex 68-P-23 fue una de las que mostró una mayor distancia genética. Lo anterior puede indicar un incremento en la variabilidad genética, la cual es indispensable para el mejoramiento genético. Estos resultados coinciden con los numerosos estudios de caña de azúcar que han demostrado la estrecha base genética de los cultivares modernos (Grivet el at., 1996; Canales et al., 2003).
Estudios realizados en genotipos de caña de azúcar han demostrado que existe un pequeño grado de diversidad a nivel del ADN entre las variedades modernas (Arro, 2005). En Cuba, también se encontró que las variedades comerciales de caña de azúcar actuales presentan baja variabilidad genética entre ellas (Arencibia et al., 2006).
Lo anterior y los resultados de la presente investigación pueden explicarse también porque los cruces de los cultivares modernos utilizados como progenitores de las primeras cruzas fueron retrocruzados varias veces con S. officinarum en un proceso conocido como «nobilización dando como resultado que los nuevos híbridos mostraran una reducción en su base genética (Deren, 1995; Jannoo et al., 1999).
CONCLUSIONES
Los resultados confirman la utilidad de los AFLP para obtener el número necesario de marcadores para el análisis del genoma, así como la caracterización y detección de polimorfismos de 12 variedades de caña de azúcar del estado de Tabasco, México.
La combinación E-ACC/M-CTA fue la que produjo mayores fragmentos polimórficos. Se encontró que existe un pequeño grado de diversidad a nivel del ADN entre las variedades cultivadas en el estado de Tabasco, México. La variedad 68-P-23 presentó una distancia genética lejana con respecto al resto de las variedades analizadas.
AGRADECIMIENTOS
Al Colegio de Postgraduados-Campus Tabasco y a la Línea Prioritaria de Investigación 5 (LPI5) Biotecnología microbiana, vegetal y animal por el apoyo económico para la realización del presente trabajo.
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