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Reseña Científica Biotecnología Vegetal Vol. 11, No. 4: 223 - 234, octubre - diciembre, 2011
ISSN 1609-1841 (Versión impresa)
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Cultivo de tejidos y transformación genética en Glycine max (L.) Merrill
J.L. Pérez-Pérez1,2
1Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal. Universidad de Granma. Carretera Bayamo-Manzanillo, km 17.5, Bayamo, Granma, Cuba. CP 85100. e-mail: jperez@udg.co.cu
2 Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830
RESUMEN
En este trabajo se realiza una breve revisión sobre los antecedentes del cultivo de tejidos y la transformación genética en el cultivo de la soya, así como una introducción al origen, distribución e importancia del cultivo. Se pretende poner a disposición del lector un compendio de resultados como preámbulo para el desarrollo de futuras investigaciones en la mejora genética de este cultivo por métodos biotecnológicos.
Palabras clave: biotecnológicos, cultivo, in vitro, mejora genética, soya
ABSTRACT
This work is a brief overview on the background of in vitro tissue culture and genetic transformation of soybean, as well as a brief introduction to the origin, distribution and importance of the crop. It is also aimed to present a series of worldwide results as a preamble to the development of future researches on genetic improvement of this crop using biotechnological methods.
Key words: biotechnology, culture, in vitro, genetic improvement, soybean
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ORIGEN Y DISTRIBUCIÓN IMPORTANCIA DEL CULTIVO MICROPROPAGACIÓN
Embriogénesis somática
Organogénesis MEJORAMIENTO GENÉTICO MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN GENÉTICA Transformación vía Agrobacterium tumefaciens Biobalística Electroporación Microinyección
MARCADORES DE SELECCIÓN CONCLUSIONES
INTRODUCCIÓN
En el contexto mundial, los granos constituyen un importante grupo de alimentos indispensables para el logro de una dieta balanceada, toda vez que aportan energía, carbohidratos, proteínas y otros elementos esenciales para la nutrición humana y animal. Se cultivan en diferentes regiones, incluyendo América Latina y el Caribe, y se
han convertido en una de las principales líneas de producción en el mundo (Penichet, 2008).
Los altos precios de los alimentos en el mundo, en gran parte motivados por la asignación de los cereales a la producción de biocombustibles, obligan a las naciones pobres a exorbitantes desembolsos financieros, de ahí que algunas de ellas,
incluyendo Cuba, experimenten soluciones alternativas a favor de la sustitución de importaciones.
En este trabajo se realiza una breve reseña sobre los antecedentes del cultivo de tejidos y la transformación genética en la soya, así como una breve introducción al origen, distribución e importancia del cultivo. Se pretende poner a disposición del lector un compendio de resultados como preámbulo para el desarrollo de futuras investigaciones en la mejora genética de este cultivo por métodos biotecnológicos.
ORIGEN Y DISTRIBUCIÓN
La familia de las leguminosas (Leguminosae) es muy extensa con alrededor de 643 géneros y 18 000 especies, agrupados en 40 tribus que se encuentran distribuidas en regiones tropicales y templadas del planeta. La tribu Phaseoleae [frijol común (Phaseolus vulgaris), frijol caupí (Vigna unguiculata) y frijol de soya (Glycine max)], considerado el grupo de mayor importancia económica con el 75% de las legumbres comerciales de todo el mundo (Broughton et al., 2003).
El cultivo de la soya, se ubica en el Reino: Plantae, Clase: Dicotiledoneae, Subclase: Archichlamideae, Orden: Rosales, Familia: Leguminosae, Género: Glycine, Especie: G . max (L.) Merril, Nombres comunes: soja, soya, soybean, entre otros (Gazzoni, 1994).
En el género Glycine han ocurrido duplicaciones seguido de reordenamientos genómicas dirigidos a la diploidización; en consecuencia el número cromosómico en G. max es 2n = 40, mientras, sus parientes silvestres 2n = 40 (G. soja Siebold & Zucc.), 2n = 80 [G. tabacina (Labill.) Benth.], 2n = 38, 40, 78 y 80 (G. tomentella Hayata). La especie G. max presenta un genoma de tamaño relativamente grande de aproximadamente 1 100 Mbp organizados en unos 20 pares de cromosomas (McClean et al., 2008).
El cultivo de la soya (Glycine max L. Merrill), es muy diferente a su ancestro silvestre, Glycine ussuriensis, que eran plantas rastreras que crecían en el Este de Asia. Probablemente 4 000 a 5 000 años atrás en el norte y centro de China, era cultivada en el valle del río Yang-Tze, en la región de Manchuria y en zonas
adyacentes a Rusia, Corea y Japón donde crecía de manera silvestre (Gazzoni, 1995).
El primer documento sobre este cultivo, es una crónica inédita escrita por el emperador Chino, Sheng-Nung, en el año 2838 A.C en su libro «Pen Tsao Kong Mu». También se cita en manuscritos posteriores, considerada una de las Fabáceas más importante y uno de los cinco granos sagrados y esenciales en la civilización China, junto al arroz, millo, centeno y el trigo (Liu, 1999).
En Europa se conoció de su existencia en 1712, por medio del botánico alemán Engelberg Kaempfer, quien residía en Japón entre 1681-1692; las primeras semillas fueron enviadas por misioneros Chinos y sembradas en 1740 en el Jardín Botánico de París. En 1765 se introdujo en EUA (Georgia) desde China y vía Londres. En 1790 se cultivó en el Jardín Botánico Real, Kew, Inglaterra (Ridner, 2006).
Se conoce que llegó a Cuba en 1904 procedente de Estados Unidos y fue sembrada en la Estación Agronómica de Santiago de las Vegas en La Habana (Socorro y Martín, 1989).
IMPORTANCIA DEL CULTIVO
Constituye uno de los diez cultivos de mayor importancia económica a nivel mundial, por ser la fuente más importante de concentrados proteicos y aceite vegetal. Como leguminosa, es capaz de asociar su sistema radicular con bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico para la biosíntesis de moléculas aminadas, como bases nitrogenadas, aminoácidos y coenzimas, reduciendo la utilización de fertilizantes nitrogenados sintéticos (Castro et al., 1993; Ponce et al., 2002).
Su composición proteica es aproximadamente 30-50%, grasas 20% y carbohidratos 24%, además contiene vitaminas (tiamina, riboflavina, ácido nicotínico, E, K, A, D y C), y minerales como: hierro, fósforo, magnesio, zinc, cobre y calcio, además contiene entre 1-5% de lecitina (Ridner, 2006; Jain et al., 2008; Radhakrishnan y Ranjitha Kumari, 2009).
Además, se emplea en la extracción de aceite para consumo humano y como base para conformar diversos productos, como son: barnices, colas, esmaltes, grasas industriales,lubricantes y tintas (Ortiz et al., 2004). Además adquiere relevancia económica por sus múltiples usos, en la industria alimenticia se utiliza en el 60% de los alimentos manufacturados, empleada como complemento dietético, derivados lácteos y forma parte de comestibles cárnicos.
Para Cuba, constituye un cultivo de importancia económica, por ser una de las fuentes más promisorias de concentrados proteicos, aceite vegetal y lecitina, rubros importados y que mantienen de forma sostenida elevados precios en el mercado internacional (Marrero y de los Ángeles, 2003).
MICROPROPAGACIÓN
El cultivo in vitro es una herramienta útil que facilita la introducción de variabilidad genética y la producción de híbridos mejorados con tolerancia a patógenos y algunas condiciones edáficas. Sin embargo, muchas leguminosas no se logran regenerar in vitro (Chandra y Pental, 2003).
La soya, es una de las leguminosas más estudiada en cultivo de tejidos, donde los sistemas de regeneración de plantas, han sido básicamente la embriogénesis somática a partir de semillas inmaduras u organogénesis a partir de cotiledones maduros (Radhakrishnan y Radhakrishnan, 2007).
Embriogénesis somática
La embriogénesis somática ha surgido como una nueva vía de propagación de plantas y constituye una herramienta de trabajo para la conservación in vitro de germoplasma (Griga, 2000) y el mejoramiento genético (Das et al., 2002). Además, ha recibido mayor atención que otros métodos de regeneración, debido que permite producir un mayor número de plantas en un periodo relativamente corto (Wu et al. 2007).
La embriogénesis somática, es definida como la reproducción asexual en el cual una estructura bipolar similar a un embrión cigótico es inducido a partir de una célula no cigótica sin conexión vascular con el tejido materno (Namasivayam, 2007).
Uno de los primeros trabajos en el establecimiento de tejidos embriogénicos en soya fue realizado por Beversdorf y Bingham (1977) a partir de suspensiones celulares de callos obtenidos de hipocótilos y cotiledones. Los callos fueron establecidos en medio de cultivo líquido con altas concentraciones de sacarosa y ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D), sin lograr la regeneración de plantas completas. Seguidamente, Christianson et al. (1983) en su estudio, emplearon suspensiones celulares de pequeñas fracciones de callo formados de ejes embrionarios y cotiledones inmaduros, de los cuales lograron regenerar plantas completas.
Diferentes tipos de explantes han sido evaluados con el objetivo de inducir callos potencialmente embriogénicos, entre ellos: hipocótilos, cotiledones inmaduros, nudos cotiledonales y raíces, con diferentes concentraciones de 2,4-D en el medio de cultivo (Bueno et al., 2004; Bolívar, 2006).
Tras años de incesante investigación, Finer y Nagasawa (1998), lograron un protocolo para la inducción de tejidos embriogénicos a partir de cotiledones inmaduros en soya. Para ello, tomaron vainas con semillas inmaduras de 7-14 días posterior a la floración, las cuales fueron esterilizadas y seleccionados los cotiledones con un tamaño entre tres a cinco milímetros de longitud, para la inducción de embriones somáticos.
Por su parte, Bonacin et al. (2000) indujeron y multiplicaron embriones somáticos de cotiledones inmaduros mantenidos en ácido naftalenacético (ANA). Estos mismos autores, refieren que con ANA (10mg l-1) y pH 7.0 lograron la mayor producción de embriones somáticos y no existieron diferencias significativas al variar la intensidad luminosa.
Igualmente, Gi et al. (2001) obtuvieron callos embriogénicos en el borde de cotiledones inmaduros en medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) con 2,4-D (40mg l-1), mientras que la producción de agregados embriogénicos fue lograda en suspensiones celulares con 2,4-D (5.0mg l-1) y asparagina (0.5mg l-1 ). Este protocolo permitió la germinación del 90% de los embriones somáticos.
Varios autores, entre los que se destacan Lippmann y Lippman (1984), Komatsuda et al. (1991) y Hofmann et al. (2004), plantearon que la iniciación de estructuras embriogénicas sobre los cotiledones fue mayor con 2-3% de sacarosa y con empleo de 2,4-D.
Trabajando en soya con la variedad Jack, Moon y Hildebrand (2003), indujeron y multiplicaron embriones somáticos en medio de cultivo con sales MS, vitamina B5 y 2,4-D (5.0 y 40mg l-1); mientras que en medio de cultivo líquido sin reguladores de crecimiento y medio de cultivo semisólido con maltosa (6.0%) y carbón activado (0.5%), lograron la maduración. En este trabajo, el porcentaje de regeneración fue relativamente bajo; no obstante, el mayor valor (35%) fue alcanzado cuando los embriones fueron secados al aire.
El 2,4-D no ha sido la única auxina usada para la producción de embriones somáticos en soya. Se ha descrito la formación de raíces adventicias sobre embriones somáticos con empleo del ácido naftalenacético (Lazzeri et al., 1987); estos embriones somáticos se caracterizaron por ser compactos, opacos, de color verde claro y formados generalmente en el borde de los cotiledones (Hofmann et al., 2004).
Es conocido que la regeneración indirecta vía formación de callo, es más ventajosa que la regeneración directa para la transformación genética al ser más efectiva la selección de las células transformadas. Sin embargo, los esfuerzos realizados para regenerar plantas por esta vía, han tenido bajos resultados sin lograr la regeneración de plantas completas en esta especie (Hu y Wang, 1999).
El tipo de explante empleado como material vegetal inicial para la formación de callo, es tan importante como el tipo y concentración del regulador de crecimiento. Por ejemplo, Coelho et al. (2003), trabajando con Glycine wightii, usaron hipocótilos y cotiledones de semillas germinadas in vitro, mantenidos a la oscuridad a 28ºC y encontraron que los cotiledones requerían para la inducción y subcultivo de los callos 2,4-D (1.0 mg l-1), kinetina (0.1 mg l-1) y sacarosa (3%), mientras que los hipocótilos requerían el doble de 2,4-D para el subcultivo.
Los tejidos pueden permanecer en estado embriogénicos indefinidamente. La
embriogénesis somática secundaria en soya, surge de la porción apical o terminal de los embriones primarios, lo cual puede ser altamente sensible en tejidos cotiledonales. En el caso de soya, esto es posible en medio de cultivo líquido con 5.0mg l»1 (Finer y Nagasawa, 1988) y en medio de cultivo semisólido con 2,4-D (20"40mg l»1) (Finer, 1988; Wright et al., 1991).
Sin embargo, Hiraga et al. (2007) observaron en la variedad Fayette una reducción en la formación de embriones somáticos cuando emplearon 2,4-D (60-80mg l-1), mientras en la variedad Japonesa Susuyutaka, se alcanzó la máxima eficiencia de inducción, demostrando diferencias en la adaptabilidad al cultivo de tejido, entre las variedades asiáticas y las americanas.
Varios trabajos describen el efecto beneficioso de diferentes tipos de aminoácidos en el cultivo in vitro de soya. La glutamina, es conocida por incrementar el tamaño de los embriones e incrementar la síntesis de aceite y proteínas de reserva. La metionina, también ha sido descrita por su utilidad en la estimulación del crecimiento. Al comparar el efecto entre la asparagina y glutamina a una concentración de 1.0g.l»1, se evidenció que la glutamina tuvo un mejor efecto al producir embriones somáticos de mayor tamaño en etapa cotiledonal (Schmidt et al., 2005).
Durante la histodiferenciación y maduración de embriones somáticos en soya, la adición de glutamina al medio de cultivo líquido, favorece la obtención de embriones somáticos más grandes, maduros en 35 días, que germinan rápido y vigorosos, siendo la mejor combinación 30mM de glutamina y 1.0mM de metionina (Schmidt et al., 2005).
Una modificación del medio de cultivo FN, denominado FN-Lite, fue desarrollada para mejorar la multiplicación en suspensiones celulares de soya. Samoylov et al. (1998) adicionaron 27.9mM de KNO3 (eliminaron el NH4NO3), 3.5mM de (NH4)2SO4, 1.4mM de KH2PO4, 2.0mM de CaCl2 y sacarosa al 3% y obtuvieron tejidos embriogénicos de alta calidad, crecimiento rápido, suave, denso, nodulares y coloración verde.
Eventualmente, en soya la suspensiones celulares forman agrupamientos de embriones somáticos en estado globular con un diámetro de 0.58.0mm, los cuales surgen de la superficie apical de los embriones somáticos primarios, siendo posible regenerar plantas directamente de estos embriones somáticos (Finer y Nagasawa, 1988).
La inducción de la histodiferenciación fue descrita por Bailey et al. (1993). Embriones en estado globular fueron transferidos a medio de cultivo semisólido (MSM6AC) sales MS, vitaminas B5, 6% de maltosa, 0.5% de carbón activado, 0.2% de Gelrite y pH 5.8, para la diferenciación de los embriones somáticos. Durante la maduración el carbón activado ayuda a eliminar las auxinas, así como al desarrollo embriogénico (Ebert y Taylor, 1990). Después de 28 días, los embriones somáticos con diferenciación hipocótilo/raíz y brotes, fueron transferidos a medio de cultivo MSM6 (MSM6AC con carbón activado) para la maduración. La maltosa, usada en lugar de la sacarosa, permite un mayor desarrollo embrionario y conversión durante la maduración (Finer y McMullen, 1991).
Alternativamente, es posible formar embriones somáticos secundarios en soya a partir de embriones somáticos primarios en medio de cultivo MS con 2,4-D (40mg l»1) o ANA (10mg l»1), finalizando el ciclo de la embriogénesis somática (Liu et al., 1992).
La embriogénesis secundaria es limitada por la diferenciación y maduración de los embriones somáticos cuando la auxina es eliminada del medio de cultivo. Finer y Nagasawa (1988) trabajando en soya con la variedad Fayette, iniciaron el cultivo de suspensiones celulares con 20"50mg de callos altamente embriogénicos en un matraz con 35ml de medio de cultivo 10A40N (conocido como FN) con sales MS (nitrógeno remplazado con 10mM de NH4NO3 y 30mM de KNO3), vitaminas B5, sacarosa al 6%, 5.0mg l»1 de 2,4-D y 15mM de glutamina, eventualmente sustituido por 5.0mM de asparagina para prevenir necrosis del tejido.
Las diferentes respuestas de los cultivares a las condiciones de cultivo son el principal obstáculo para la regeneración de soya vía embriogénesis somática. Por ello, un cultivar que presenta una alta capacidad de inducción de embriones somáticos no necesariamente es el que muestra una mayor capacidad de
conversión de embriones somáticos en planta (Santos et al., 1997).
De forma similar, el tamaño del explante influye en la formación de embriones somáticos. Al evaluar diferentes tamaños de cotiledones inmaduros en soya para la inducción de embriones somáticos, Klink et al. (2008), observaron que cotiledones menores de un milímetro y mayores de cinco milímetros, no desarrollaban embriones somáticos, alcanzando a los 30 días de cultivo un 90% de los explantes con formación de embriones somáticos en cotiledones de tres milímetros en la variedad Williamns con respecto a un 45% en la variedad MiniMax.
Organogénesis
La organogénesis en soya involucra la regeneración de brotes directamente de células meristemáticas o de tejidos próximos a estas. Estos brotes pueden surgir de los tejidos de los explantes con o sin una fase de callo. Además es menos dependiente del genotipo en comparación con la embriogénesis somática ya que cada planta tiene meristemos axilares capaces de regenerar. Sin embargo, la respuesta es diferente entre los cultivares, debido al vigor, crecimiento de los explantes in vitro y su sensibilidad a los componentes del medio de cultivo (Olhoft y Somers, 2007).
Las primeras plantas de soya fueron regeneradas mediante el cultivo in vitro de secciones de hipocotilos, con posterioridad diversos tipos de explantes han sido utilizados para la regeneración de plantas vía organogénesis directa. Estos explantes primarios incluyen segmentos de nudo cotiledonal, epicotilos, segmentos de hojas, cotiledones, plúmulas, hipocotilos y ejes embrionarios.
El tiempo de regeneración de plantas a partir de células meristemáticas axilares o apicales, es mucho más corto que en la embriogénesis somática. Los brotes primarios, se forman alrededor de una semana en medio de cultivo de inducción, y la formación de plantas es generalmente al cabo de un mes. Debido al corto tiempo de cultivo, la fertilidad de las plantas regeneradas no suele ser afectada, de aquí que muchos protocolos de regeneración en soya, se centran en el establecimiento de múltiples brotes en células meristemáticas axilares (Olhoft y Somers, 2007).
En muchas especies la regeneración vía callo es generalmente ventajosa sobre la regeneración directa en la transformación de plantas durante la selección de plantas transgénicas. Sin embargo, durante los últimos 30 años, han sido limitados los eventos de regeneración de a partir de callos organogénicos de soya (Hong et al., 2007).
Aunque la inducción de callo organogénico ha sido lograda mediante el cultivo de cotiledones inmaduros, el desarrollo de yemas adventicias y el crecimiento de estas yemas ha sido ineficiente, sugiriendo que solo parte de estos callos son competentes para la regeneración. Sairam et al. (2003) obtuvieron callo órganogénico y la diferenciación de brotes a partir del nudo cotiledonal de plántulas jóvenes.
En trabajo realizado por Shan et al. (2005) determinaron que explantes obtenidos de plántulas preparadas con Tidiazurón (TDZ) incrementaron el número de brotes desarrollados. Kaneda et al. (1997) lograron en la variedad Bonminori formar brotes a partir de hipocótilos como explante, en medio de cultivo MS, sin embargo, Shan et al. (2005) trabajando con el mismo explante no lograron formar brotes en la variedad White hilum.
MEJORAMIENTO GENÉTICO
El trabajo de mejoramiento genético es una necesidad constante de la agricultura, con el fin de obtener variedades mejor adaptadas al medio ambiente, tanto a través de los métodos clásicos de mejora, como por los biotecnológicos, nucleares y de fitomejoramiento participativo.
En 2008, la superficie global dedicada a la producción de cultivos transgénicos mantuvo su incremento hasta alcanzar los 125 millones de hectáreas, partiendo de los 114.3 millones de 2007. La soya transgénica continuo siendo el principal cultivo transgénico en 2008, con 65.8 millones de hectáreas que representan el 53% de la superficie de cultivos transgénicos a nivel mundial. La tolerancia a herbicidas en soya, maíz, canola, algodón y alfalfa ocupó el 63% de los 125 millones de hectáreas de cultivo transgénicos de todo el mundo (James, 2008).
En soya, un gran número de protocolos de transformación genética han sido establecidos durante años, vía Agrobacterium tumefaciens y la biobalística. Sin embargo, no se ha logrado como en otros cultivos una metodología de transformación eficiente (Stacey et al., 2004; Cao et al., 2009).
Además de la transformación nuclear, la transformación de cloroplastos se emplea para la síntesis de proteínas foráneas en plantas (Maliga, 2004). Basados en este principio, Dufourmantel et al. (2004) obtuvieron plantas transplastómicas de soya, lo cual tiene como beneficios la transmisión de transgenes a través de tejido materno y posiblemente mayor expresión de genes que mediante transformación nuclear.
MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN GENÉTICA
Transformación vía Agrobacterium tumefaciens
Varios autores refieren la transformación genética en soya mediante A. tumefaciens, entre los que se encuentran Hinchee et al. (1988) quienes transformaron hojas cotiledonales para que expresaran resistencia a kanamicina y tolerancia a glifosato.
Los protocolos de transformación mediante Agrobacterium en embriones somáticos de soya, en su mayoría emplean cotiledones inmaduros y no buscan una multiplicación significativa de los embriones somáticos secundarios en medio de cultivo líquido (Ko et al., 2004).
En este sentido, Parrott et al. (1989) emplearon cotiledones inmaduros de aproximadamente cinco milímetros de longitud de 14 genotipos. Los explantes fueron cortados y colocados con la región adaxial (plana) en medio de cultivo semisólido N10 (sales MS, vitaminas B5, 1.5% de sacarosa, 10mg l-1 de ANA, 0.2% de Gelrite, pH 5.8) y co-cultivados a la oscuridad con A. tumefaciens a 28°C. Las células transformadas fueron seleccionadas con geneticina (10mg l-1) (G418) durante 30 días en medio de cultivo N10.
Igualmente, Yan et al. (2000) para la transformación y producción de embriones somáticos del cultivar Jack, utilizaron cotiledones inmaduros de 4 a 10mm de longitud y obtuvieron expresión GUS y supervivencia de los explantes. Aunque de cuatro a siete milímetros es el tamaño óptimo de los cotiledones para inducir embriones somáticos, según Finer (1988), cotiledones de ocho milímetros de longitud sobrevivieron a la infección de Agrobacterium (DO600= 0.2-1.0) (Yan et al., 2000; Ko y Korban, 2004).
En la selección de células transgénicas en medio de cultivo semisólido de inducción y maduración, se requieren nueve meses para llevar las plantas a campo, lo cual puede ser reducido de 4 - 5 meses con una fase de multiplicación en medio de cultivo líquido. La capacidad de producir plantas transgénicas en un plazo de cinco meses fue en gran parte debido al empleo del agente de selección higromicina B (Ko et al., 2003).
Se ha demostrado incrementos en la eficiencia de transformación en cotiledones de soya cuando son sometidos al método de transformación SAAT (Sonicación Asistida con Agrobacterium tumefaciens). La sonicación, produce microheridas en la superficie de cotiledones seguido de incrementos en la infección de la bacteria al producir compuestos que estimulan el crecimiento de la bacteria bajo condiciones aeróbicas (Trick y Finer, 1998; Droste et al., 2000; Finer y Finer, 2000).
Diferentes publicaciones refieren a la eficiencia de transformación en soya. Zeng et al. (2004) describieron una eficiencia de transformación en la variedad Williams-82 de 0.1 a 5.9% usando A. tumefaciens y como explante el nudo cotiledonal. También, Paz et al. (2004) obtuvieron eficiencias de transformación de 2.0 a 6.3% en las variedades Willams 79 y Williams respectivamente empleando A. tumefaciens, nudo cotiledonal y glufosinato como agente de selección. Con posterioridad, Tran Thi Cuc Hoa (2008) informaron una eficiencia de transformación en soya en un rango de 1.0 a 5.0%.
Mediante el método de la media semilla «half seed», Paz et al. (2006) alcanzaron una mayor eficiencia de transformación en comparación con el método del nudo cotiledonal. Por otra parte, Liu et al. (2008) obtuvieron una eficiencia de transformación de 3.8 a 11.7% en cinco
variedades de soya chinas usando A. tumefaciens e higromicina como agente de selección.
Biobalística
Entre los pioneros en la transformación genética mediante biobalística en soya están McCabe et al. (1988) quienes transformaron tejidos meristemáticos de ejes embrionarios de semillas inmaduras. Estos una vez transformados fueron cultivados in vitro para inducir la formación de embriones somáticos de los que se desarrollaron plantas que expresaban y heredaban el gen nptII de resistencia a la kanamicina.
La biobalística permite la integración de múltiples copias de transgenes en el genoma de plantas transformadas existiendo referencias de hasta 100 copias de un transgén (Reddy et al., 2003). En soya es comúnmente usada para la transformación de suspensiones celulares embriogénicas (Finer y McMullen, 1991) y brotes meristemáticos (Aragão et al., 2000).
En el trabajo publicado por Bobrowski y Dode (2006), se evaluó el efecto de diferentes presiones de helio y concentraciones de manitol como pre-acondicionamiento osmótico en embriones somáticos de soya variedad Bragg obtenidos a partir de cotiledones inmaduros. Los tejidos fueron bombardeados con el plásmido pGusHyg, que contenía el gen GUS y el marcador de selección hpt. En todas las combinaciones, fue observado un aumento en la expresión transitoria cuando los tejidos embriogénicos fueron pre-acondicionados con 0.25M de manitol por una hora y presión de gas helio de 300psi (Pounds per Square Inch).
El primer trabajo de transformación genética de soya mediante bombardeo de partículas en masas embriogénicas antes de la inoculación con Agrobacterium en las variedades IAS5 y Bragg, fue desarrollado por Droste et al. (2000), quienes describen un nuevo método que combina las ventajas de la embriogénesis somática y la transferencia de genes mediante un sistema integrado de transformación.
Mediante biobalística Yemets et al. (2008) transformaron callos embriogénicos en la variedad de soya Kiev-91, logrando unafrecuencia de transformación de 5-6%, empleando como marcador de selección un gen mutante de la tubulina que le confiere resistencia a las plantas frente al herbicida dinitroaniline.
Electroporación
En la literatura consultada se hace referencia al uso de esta tecnología en la producción de plantas transgénicas de soya. En el trabajo de Widholm et al. (1992) se obtuvieron protoplastos de semillas inmaduras variedad Clark 63 que fueron electroporados con el ADN y un gen de resistencia a kanamicina o higromicina y el gen reportero que codifica para â-glucuronidasa. De una colonia de 2 000 protoplastos electroporados (0.05%), el 75-90% expresaron resistencia al antibiótico, lo cual no fue evidente en los protoplastos usados como controles.
Otro trabajo en la producción de plantas transgénicas de soya fue descrito por Chowrira et al. (1996) al integrar un plásmido circular de ADN en yemas axilares de plantas adultas. La región apical de plantas de tres semanas de cultivo fue cortada próximo al nudo de las hojas completamente abiertas y eliminadas las estípulas y pecíolos exponiendo las yemas axilares. El plásmido de ADN fue suspendido en una solución salina e inyectada en las yemas nodales a una profundidad de un milímetro usando una jeringuilla. Después de 20 minutos, cada planta fue electroporada con dos impulsos de 99ms a 200V para colocar la yema nodal en una solución de ADN con un electrodo circular. Las plantas fueron llevadas a invernadero y posteriormente fue confirmada la integración del ADN, mediante la técnica molecular Southern blot en semillas de la progenie.
Microinyección
Para la transformación en soya también ha sido utilizada la microinyección con Agrobacterium en semillas (Chee et al., 1989), primeramente las semillas fueron pregerminadas durante 18 - 24 horas en papel estéril húmedo en la oscuridad; luego se eliminó la testa, seguido de los cotiledones con la plúmula; los nudos cotiledonales fueron inyectadas mediante una aguja con 30ì l de Agrobacterium a DO600=0.5. Las semillas fueron colocadas en la oscuridad
a 26°C por cuatro horas y luego plantadas en suelo hasta completar el desarrollo vegetativo. De 4 000 semillas inoculadas, 2 200 dieron origen a plantas completas, de las cuales solo diez expresaron la actividad enzimática del transgén nptII, con una eficiencia de transformación de 0.03%. La trasmisión del ADN-Ti a la primera descendencia solo fue detectada en algunos descendientes de una línea transgénica, sugiriendo que los progenitores eran plantas quiméricas.
MARCADORES DE SELECCIÓN
La selección de células transgénicas en soya, ha sido descrita para el gen nptII que confiere resistencia a kanamicina (Zhang et al., 1999), el gen epsps para resistencia a glifosato (Clemente et al., 2000) y el gen hpt para la selección con higromicina fosfotransferasa (Olhoft et al., 2007).
Los tejidos vegetales en soya son altamente sensibles a higromicina y, por tanto, la selección de células transgénicas sobre las células no transgénicas ocurre muy temprano en el desarrollo embrionario. La reducción del tiempo de cultivo es muy importante para el desarrollo de un método eficiente de transformación, así como, para la fertilidad de las plantas regeneradas (Olhoft et al., 2007).
De los genes marcadores de selección, el nptII ha mostrado los resultados más débiles en la mayoría de los «escapes» no transformados. Una alta eficiencia de transformación (>10%) ha sido encontrada al emplear un régimen de selección estricto con participación de higromicina fosfotransferasa (Olhoft et al., 2003), con poca producción de plantas quiméricas o no «escapes» (Olhoft et al., 2004).
La adicción de compuestos tiolados en los medios de co-cultivo resultan en un incremento significativo en la transformación, cuando se han empleado como explantes nudos cotiledonales de soya (Olhoft et al., 2001).
Estos compuestos permiten reducir la necrosis en los cortes del tejido vegetal e infección de Agrobacterium por inhibición de la actividad del patógeno en la planta y la producción de enzimas tales como: peroxidasas y polifenol oxidasa (Olhoft et al., 2007).
En estudios realizados con glufosinato como agente de selección y la adición de compuestos tiolados durante el co-cultivo, permitió un incremento en la eficiencia de transformación entre 0.9 - 2.1% usando L-cisteína a razón de 3.3 - 8.8mM (Olhoft y Somers, 2001) de 0.2 -0.9% con L-cisteína (3.3mM) y de 0.6 - 2.9% con 1.0mM DTT (DL-Dithiothreitol) (Paz et al., 2004) y de 0.2 5.9% con L-cisteína (3.3mM) (Zeng et al., 2004).
También ha sido descrita una transformación eficiente de 16.4% cuando los explantes fueron co-cultivados con DTT (1.0mM), tiosulfato de sodio (Na2S2O4) (1.0mM) y L-cisteína (8.8mM) combinados con el agente de selección hpt (Olhoft et al., 2003).
CONCLUSIONES
El cultivo de la soya se caracteriza por presentar poca variabilidad entre los cultivares, lo que limita los programas de mejoramiento genético mediante métodos convencionales. Sin embargo, los cultivares muestran diferencias durante el cultivo in vitro y la transformación genética.
Aunque a nivel internacional han sido producidas plantas transgénicas en soya, las metodologías de transformación y regeneración que existen, presentan bajas eficiencias, frecuente obtención de plantas quiméricas y son específicas para determinadas variedades que muestran una mejor respuesta embriogénica.
Existen diferentes métodos para la transformación genética en soya, de ellos, la transformación mediante biobalística y Agrobacterium tumefaciens, son los más usados y su efectividad varía acorde al tipo de tejido empleado, edad, genotipo y susceptibilidad a la infección con la bacteria.
Las metodologías de transformación que emplean el A. tumefaciens se caracterizan por ser sencillas, de bajo costo, resultan en pocas copias de los transgenes y son reducidos los problemas de expresión. Sin embargo, aunque es una planta dicotiledónea y hospedera de Agrobacterium, presenta dificultades para la transformación mediante este vector, siendo limitados los trabajos de transformación genética de embriones somáticos, además, no
existe una metodología para la transformación genética de embriones somáticos mediante A. tumefaciens en variedades cubanas de soya.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se realizó en el marco del Programa de Cooperación Universitaria Institucional entre la Universidad Central Marta Abreu de Las Villas y el Consejo de Universidades Flamencas de Bélgica (IUC UCLV/VLIR) y forma parte de la tesis doctoral del autor.
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