Vol.10, No.3, 2010.pmd 
Reseña Científica                                                                   Biotecnología Vegetal Vol. 10, No. 3: 131 - 141, julio - septiembre, 2010

ISSN 1609-1841 (Versión impresa)
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)

 

Metabolismo de cardenólidos y transformación genética de Digitalis. Potencialidades y retos

Yovanny Izquierdo*, Naivy Pérez-Alonso, Elio Jiménez.*Autor para correspondencia

Instituto de Biotecnología de las Plantas. Carr. a Camajuaní km 5.5. Santa Clara, Villa Clara. Cuba. CP 54 830 e-mail: yovanny@ibp.co.cu

RESUMEN

Los cardenólidos son metabolitos secundarios, producidos por las plantas del género Digitalis, que se utilizan ampliamente en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. El fracaso de los intentos por potenciar su producción a partir de técnicas de cultivo in vitro, ha señalado a la transformación genética como una estrategia promisoria para la obtención de plantas altamente productoras. Para alcanzar este objetivo se han desarrollado sistemas de transformación en Digitalis minor y Digitalis lanata, y existen trabajos científicos relacionados en otras especies del género. La selección de genes candidatos para la transformación de Digitalis requiere del conocimiento de la ruta de biosíntesis de cardenólidos, la cual está solo parcialmente establecida. Sin embargo, el descubrimiento reciente de dos genes que codifican esta actividad enzimática en Digitalis purpurea con patrones de expresión diferentes pone en duda esta aseveración. La flexibilidad de la ruta y sus posibles conexiones con otros procesos de síntesis de hormonas entrañan un reto adicional. Por lo tanto, se hacen necesarios estudios funcionales de estos genes y sus vías de señalización para el diseño de estrategias de transformación que maximicen la producción de cardenólidos con un mínimo de posibles efectos colaterales que pudieran dar al traste con la viabilidad de las plantas transformadas. Esta reseña bibliográfica pretende hacer una revisión acerca del metabolismo de los cardenólidos y los esfuerzos por transformar genéticamente plantas del género Digitalis. Sobre esta base se evalúan críticamente las potencialidades de transgenes candidatos para la obtención de plantas de Digitalis con una producción más elevada y estable de glicósidos cardíacos.

Palabras clave: glicósidos cardíacos, progesterona 5-â reductasa, ingeniería metabólica

ABSTRACT

Cardenolides are secondary metabolites produced by plants of the genus Digitalis. These are widely used in treatments of congestive heart failure. Failed attempts to obtain suitable cardenolide levels from in vitro culture of Digitalis plants have pointed genetic transformation as a promising strategy to obtain highly productive plants. Transformation systems have been already developed for Digitalis minor and Digitalis lanata to achieve this aim, whereas related investigations have been done in other species of the same genus. Selection of candidate genes for transformation depends on the analysis of the cardenolide biosynthesis pathway. The latter is partially established, from phytosterol oxidative degradation to progesterone reduction. Many authors point this reaction as the first specific key step of the pathway. However, the recent discovery of two genes encoding this enzyme activity in Digitalis purpurea, with different expression patterns, calls this statement into question. Pathway flexibility and possible connections with other hormone-related processes imply an additional challenge in this regard. Therefore, functional studies of these genes and their signaling pathways are required to improve design Digitalis transformation strategies, maximizing cardenolide productivity as well as minimizing hazardous side effects on transformed plants viability.

Key words: cardiotonic glycosides, progesterone 5-â reductase, metabolic engineering.

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN DIGITALIS

Origen y clasificación

Importancia farmacológica CARDENÓLIDOS

Estructura y propiedades farmacológicas. Mecanismo de acción

Metabolismo

Flexibilidad de la ruta de biosíntesis TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE DIGITALIS

Antecedentes

Selección de nuevos genes candidatos para transformación de Digitalis CONCLUSIONES

INTRODUCCIÓN

Los glicósidos cardiotónicos o cardenólidos constituyen los medicamentos más extensamente empleados a nivel mundial en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca (Gavidia et al., 2007). Hasta la fecha, las plantas de los géneros Digitalis e Isoplexis son las únicas fuentes viables desde el punto de vista económico para la producción de estos metabolitos secundarios a escala industrial, de ahí que haya existido siempre un gran interés en el desarrollo de estrategias para fomentar su producción (Hagimori et al., 1980; Sales et al., 2007).

El cultivo in vitro de Digitalis ha sido extensamente explorado en este sentido, tratando sin éxito de lograr la producción de cardenólidos en suspensiones celulares con el empleo de biorreactores (Hagimori et al., 1980). Más tarde se descubrió que la biosíntesis de estos glicósidos se produce sólo en tejidos verdes diferenciados (Stuhlemmer y Kreis, 1996), por lo que solo mediante la propagación de plantas en sistemas de inmersión temporal se obtienen niveles apreciables, aunque todavía mucho menores que los alcanzados en condiciones de campo (Pérez-Alonso et al., 2009).

La ingeniería metabólica permite la manipulación de rutas biosintéticas de interés para modificar los niveles de determinados metabolitos, ya sea por adición de precursores, modificación de condiciones de cultivo o transformación genética (Venepoorte et al., 1999). Respecto a la biosíntesis de cardenólidos, la adición de precursores como la progesterona al medio de cultivo produce un aumento significativo de la biosíntesis (Hagimori et al., 1982), pero su alto costo hace esta estrategia inviable en la práctica. Como consecuencia, la transformación genética con un gen involucrado en la biosíntesis de este precursor o su canalización hacia la ruta de biosíntesis de los cardenólidos aparece como una alternativa promisoria para obtener plantas con una productividad elevada. Como ventaja adicional, este enfoque permitiría, en combinación con las técnicas de cultivo in vitro, propagar masivamente plantas transformadas con una productividad más uniforme que la registrada en condiciones naturales (Neczypor, 1969). Esta estrategia ha sido empleada con éxito en la manipulación de otras rutas metabólicas secundarias en plantas, como los flavonoides (De Clercq et al., 2002) y alcaloides (Charest et al., 2004).

El desarrollo de una estrategia para la obtención de plantas genéticamente modificadas que produzcan cantidades mayores de algún compuesto de interés, requiere de la existencia de un sistema de regeneración de plantas, un protocolo de transformación y un gen (o varios genes) que potencie(n) la biosíntesis del metabolito en cuestión. Esta reseña bibliográfica pretende hacer una revisión acerca del metabolismo de los cardenólidos y los esfuerzos por transformar genéticamente plantas del género Digitalis. Sobre esta base se evalúan críticamente las potencialidades de transgenes candidatos para la obtención de plantas de Digitalis con una producción más elevada y estable de glicósidos cardíacos.

DIGITALIS

Origen y clasificación

Digitalis es un género que comprende alrededor de 20 especies herbáceas bienales, perennes y arbustos perteneciente a la familia Scrophulariaceae (sin incluir las especies de Isoplexis, que según Herl et al. (2008) también deberían ser clasificadas dentro del mismo género). Estas plantas son nativas de Europa, noroeste de África y Asia central y occidental, aunque se han naturalizado en otras regiones subtropicales y templadas del planeta (Hultén, 1968). Su uso se ha extendido debido a sus propiedades medicinales y ornamentales, principalmente en las especies D. purpurea y D. lanata. Algunas especies del género se han intentado introducir en Cuba donde su crecimiento en condiciones de campo se produce de manera rápida en otoño e invierno pero la llegada del verano, por lo general, ocasiona la muerte de la planta por la ocurrencia de altas temperaturas y abundantes lluvias (Roig, 1974).

Importancia farmacológica

Las plantas de Digitalis han sido empleadas desde la antigüedad en el tratamiento de enfermedades cardíacas de manera empírica. Sin embargo, no fue hasta 1785 que William Withering describió las propiedades medicinales de D. purpurea en el tratamiento de hidropesía, enfermedad caracterizada por la acumulación excesiva de líquido en los tejidos y que en la medicina moderna se reconoce como una consecuencia de la insuficiencia cardíaca (Withering, 1785). En este mismo trabajo también se describían por primera vez los efectos tóxicos derivados de dosis elevadas de preparaciones de la planta. En 1799 la acción farmacológica de D. purpurea fue relacionada con su efecto sobre el corazón (Ferriar, 1799). Estudios posteriores demostraron que la digital (como comúnmente se le conoce) contiene una serie de sustancias cardiotónicas muy activas de naturaleza esteroideo-glicosídica conocidas como glicósidos cardiotónicos, o más formalmente cardenólidos. Además, la planta produce otros compuestos no glicosídicos como la digitoflavina, el ciclohexanol, taninos, ácidos málico y succínico, los cuales complementan la acción de aquellos (Melero et al., 2000). En la actualidad varios cardenólidos, principalmente la digoxina y sus derivados, son utilizados en la terapia cardíaca. Su importancia es tal que no han podido ser sustituidos hasta la fecha, al menos en el tratamiento a gran escala (Gavidia et al., 2007).

CARDENÓLIDOS

Estructura y propiedades farmacológicas. Mecanismo de acción

Los cardenólidos son moléculas caracterizadas por un núcleo esteroideo (genina o aglicona) que cuenta con un grupo hidroxilo en la posición C14â y un anillo lactónico insaturado de cinco miembros en la posición C17â. Varias de las demás posiciones de la fracción genina pueden tener también sustituyentes como grupos hidroxilo, formilo o acetilo (Kreis et al., 1998; Herl et al., 2005).

A la posición C3â se une una cadena de oligosacáridos típicamente de hasta cinco unidades dentro de las cuales es usual encontrar azúcares poco comunes (Melero et al., 2000) (Figura 1). En cuanto a sus patrones de glicosilación, los cardenólidos se clasifican en primarios, si el azúcar terminal es la glucosa, o secundarios en caso contrario. El núcleo esteroideo tiene, además, la característica peculiar de tener sus cuatro anillos fusionados en la secuencia cis-trans-cis desde el A hasta el D (Figura 2), lo cual le confiere la actividad farmacológica a estos compuestos (Melero et al., 2000).

Los glicósidos cardiotónicos pueden ser definidos como inhibidores alostéricos de la ATPasa Na+-K+, que se unen de manera no covalente a esta (Repke et al., 1989). La ATPasa Na+-K+ (E.C. 3.6.1.37) es una enzima transportadora presente en casi todos los tipos de células del reino animal. Su función es movilizar iones sodio hacia el exterior celular a la vez que transporta iones potasio a la célula, a costa de la hidrólisis de ATP. El gradiente iónico generado es utilizado como fuente de energía para el transporte de otros iones y moléculas necesarias para el funcionamiento celular (Skou, 1965).

De acuerdo con el mecanismo de acción de los glicósidos cardiotónicos, estos inhiben la mencionada ATPasa (alrededor del 30% con dosis terapéuticas) causando un incremento intracelular de Ca2+ en el músculo cardíaco y por consiguiente un aumento en la fuerza de la contracción (Thomas et al., 1990). Dosis elevadas de estos glicósidos provocan la paralización en cadena de numerosos procesos de transporte secundario de iones y nutrientes que dependen de la ATPasa Na+-K+, lo cual conduce a la muerte celular y es la base de la toxicidad de estos compuestos. Debido a esto se ha propuesto que la función natural de los cardenólidos sea como repelentes de herbívoros que traten de alimentarse de las hojas de plantas del género Digitalis (Malcolm y Zalucki, 1996; Pérez-Bermúdez et al., 2010).

Metabolismo

Debido al potencial farmacológico de los cardenólidos, se han hecho consistentes esfuerzos por dilucidar sus rutas de biosíntesis y posterior degradación. Sin embargo, las limitaciones técnicas derivadas de la escasez de datos genómicos de esta especie combinadas con la complejidad de la red metabólica en la que se encuentran inmersos, ha provocado que el conocimiento de dichas vías metabólicas sea aún incompleto.

La biosíntesis de los cardenólidos puede decirse que comienza a partir de la degradación oxidativa de la cadena lateral de los fitosteroles (colesterol, campesterol, sitosterol, estigmasterol) por la enzima colesterol monooxigenasa (EC 1.14.15.6) o enzima degradadora de cadenas laterales (SCCE, del inglés: side chain cleaving enzyme) (Figura 3). El producto de esta reacción es la pregnenolona, la cual es oxidada reversiblemente a pregn-5-eno-3,20-diona por la enzima Ä5-3â-hidroxiesteroide deshidrogenasa (EC 1.1.1.145) (3âHSD, siglas en inglés). Este último compuesto se transforma rápidamente en su isómero pregn-4-eno-3,20-diona (progesterona). No queda claro si la actividad Ä5- Ä4 cetoesteroide isomerasa reside en la propia 3âHSD, en otra enzima asociada o si la reacción ocurre espontáneamente por vía no enzimática debido a la mayor estabilidad del producto Ä4 (Lindemann y Luckner, 1997; Finsterbusch et al., 1999).

La próxima reacción de la ruta es la reducción del doble enlace de la progesterona para dar 5â-pregnano-3,20-diona, primer compuesto en el que aparece la conformación 5â característica de los cardenólidos y que por consiguiente se considera el primer paso comprometido absolutamente con la producción de estos compuestos (Gavidia et al., 2007). La reacción es catalizada por la progesterona-5â-reductasa, actividad codificada por al menos dos genes en D. purpurea (Pérez-Bermúdez et al., 2010). A continuación, la 5â-pregnano-3,20-diona es reducida en su posición C3 a 5â-pregnano-3â-ol-20-ona por la propia 3âHSD (Finsterbusch et al., 1999). La ruta continúa por derivados de pregnano a partir de las hidroxilaciones en C14 y C20 hasta la condensación en esta última posición con Acetil-CoA y la formación del anillo lactónico (Kreis et al., 1998). La sucesión de enzimas en esta porción de la ruta, sin embargo, no se encuentra descrita.

En general, se asume que la adición de azúcares a la posición C3 se produce luego de la formación de la aglicona, aunque no existen evidencias definitivas acerca de la secuencia relativa de los eventos de glicosilación e hidroxilación. La glicosilación de los glicósidos secundarios a primarios es catalizada por la enzima citosólica y soluble UDP-glucosa: digitoxina 16'-O-glucosiltransferasa (DGT, EC 2.4.1.-) en D. lanata (Kreis et al., 1986). Estos glicósidos primarios son considerados la forma fundamental de almacenamiento en la vacuola central (Hoelz et al., 1992). Otra enzima relacionada con la biosíntesis tardía de los cardenólidos es la también soluble y citosólica Acetil-CoA:digitoxina 15'-O-acetil transferasa (DAT, EC 2.3.1.-) que cataliza la formación de los lanatósidos a partir de sus precursores no acetilados (Sutor et al., 1990). Este grupo de cardenólidos se denomina de esta forma por ser los más abundantes en D. lanata.

El metabolismo de degradación y movilización de los cardenólidos también ha sido estudiado. Al respecto, se han descrito las cardenólido glucohidrolasas (CGH) I y II. CGH-I es una enzima de membrana, mientras que CGH II es soluble en el citosol (May y Kreis, 1997; Hornberger et al., 2000). Ambas hidrolizan rápidamente los glicósidos primarios vacuolares una vez que la compartimentación celular es eliminada, aunque sus especificidades de substrato difieren. En particular, CGH II sólo acepta glicósidos no acetilados, de manera que no puede hidrolizar lanatósidos, que sí son procesados por CGH I. De manera general, ambas enzimas se relacionan con la movilización de cardenólidos desde la vacuola presumiblemente ante ataques de herbívoros (Hornberger et al., 2000). Además, se ha descrito una lanatósido 15'-O-acetilasa, supuestamente vinculada a los mismos procesos de CGH-I y CGH-II (Sutor et al., 1990).

Flexibilidad de la ruta de biosíntesis

Los esteroides son sustancias estructuralmente relacionadas con muchas y muy diversas funciones en la fisiología de las plantas. Estas pueden ser estructurales, hormonales, de defensa, etc. Como consecuencia de esto las rutas metabólicas que se involucran son a menudo complejas. En el caso de la biosíntesis de cardenólidos, la primera parte de la ruta hasta la formación de progesterona se ramifica hacia otras vías metabólicas en plantas (Mueller et al., 2003). De hecho, el suministro de colesterol o pregnenolona al medio de cultivo de D. purpurea no se traduce en un aumento de la producción de cardenólidos según resultados publicados por Hagimori et al. (1983) y atribuidos al hecho de que estos esteroles son precursores de otras rutas metabólicas. Sin embargo, Sales et al. (2007) han logrado obtener líneas transgénicas de Digitalis minor que sobreexpresan el dominio catalítico de la enzima hidroximetil glutaril CoA reductasa (HMGCoA reductasa) de Arabidopsis thaliana y presentan mayor contenido de cardenólidos que las plantas no transformadas. HMGCoA reductasa es una enzima clave en la ruta de síntesis de esteroles que desemboca en la síntesis del colesterol, por lo que en principio su sobreexpresión debe afectar a todos los esteroles derivados de este, incluidos los cardenólidos.

Existe por tanto una aparente contradicción con los experimentos de suministro de colesterol de Hagimori et al. (1983), que puede explicarse al considerar, por una parte, la diferente naturaleza de inducción metabólica que existe entre suministrar un metabolito y sobreexpresar un gen; y por otra, la aleatoriedad de los eventos de transformación genética que pueden provocar activación o represión de otros genes de manera que el efecto observado pueda no sólo deberse al transgén en sí, sino además, al lugar donde se inserte. Apunta a esto último el hecho de que no todas las líneas transgénicas obtenidas en el mencionado trabajo mostraron un incremento en el contenido de cardenólidos.

 

Más adelante en la ruta, la enzima 3âHSD es un buen ejemplo de plasticidad por cuanto cataliza varias reacciones tanto dentro de la biosíntesis de los cardenólidos como la de los pregnanos 5á-derivados (Finsterbusch et al., 1999).

Sólo a nivel de la progesterona es que se observa una respuesta de síntesis de glicósidos ante la administración del substrato, lo cual soporta la hipótesis de que su reducción en 5â es la primera reacción específica de la ruta (Gärtner y Seitz, 1993). No obstante, la progesterona se encuentra relacionada con otros procesos fisiológicos vegetales, aunque el conocimiento al respecto es limitado. Ylstra et al. (1995) demostraron que varias hormonas animales, incluida la progesterona, estimulaban la germinación y el crecimiento del tubo del polen en tabaco (Nicotiana tabacum). Además, se ha demostrado que puede inducir floración o desarrollo generativo en cebada (Hordeum vulgare) (Janeczko y Filek, 2002) y A. thaliana (Janeczko et al., 2003).

La á-reducción de la progesterona a 5á-pregnano-3,20-diona es el camino alternativo a la síntesis de los cardenólidos que puede seguir esta sustancia, para dar lugar a una ruta que desemboca en la síntesis de los brasinoesteroides (Clouse y Sasse, 2003; Iino et al., 2007). Estos son fitohormonas a las que se les atribuyen una variedad de funciones como la elongación celular, división celular, diferenciación vascular y modulación de respuestas a estrés (Clouse y Sasse, 2003).

Por último, el hallazgo de que la actividad progesterona 5â-reductasa está codificada por al menos dos genes (p5âr y p5âr2) en D. purpurea, reafirma la complejidad del contexto de la ruta de los cardenólidos (Pérez-Bermúdez et al., 2010). De estos dos genes, p5âr2 parece estar relacionado directamente con la biosíntesis en respuesta a condiciones de estrés, mientras que p5âr mantiene una expresión basal que pudiera estar relacionado con otras funciones desconocidas (Pérez-Bermúdez et al., 2010). Esto concuerda con el hecho de que su ortólogo en A. thaliana ( vep1, del inglés: Vein Patterning 1) fue inicialmente involucrado en la diferenciación vascular (Jun et al., 2002), y sólo después se demostró su actividad enzimática (Herl et al., 2009) lo cual pone en tela de juicio el argumento de que la reducción 5â de la progesterona es una reacción absolutamente comprometida con la síntesis de glicósidos cardiotónicos.

Todos estos elementos demuestran la relación de la biosíntesis de cardenólidos con otros procesos fisiológicos. Tal interconexión implica una fina regulación por parte de la planta, pero además entraña un reto en las proyecciones de ingeniería metabólica para incrementar la producción de estos fármacos en el género Digitalis.

TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE DIGITALIS

Antecedentes

Por su importancia en la industria farmacéutica, las plantas del género Digitalis han sido objeto de numerosas estrategias para aumentar su productividad. Desde hace décadas se han venido explorando las bondades del cultivo in vitro en este sentido. Sin embargo, los rendimientos obtenidos ya sea a partir de cultivos celulares o de brotes son significativamente menores que en condiciones de campo (Hirotani y Furuya, 1977; Hagimori et al., 1980; Pérez-Alonso et al., 2009). Es por ello que la ampliación del conocimiento de las rutas de biosíntesis de cardenólidos ha incrementado el interés por incluir la transformación genética dentro de las alternativas de mejoramiento genético en este género. Sin embargo, hasta el momento existen solo unos pocos antecedentes de transformación genética en Digitalis.

Los trabajos más sostenidos de transformación en este género han sido realizados en la especie D. minor. En un primer intento, Sales et al. (2002) describieron la regeneración eficiente de la plantas a partir de explantes foliares infectados con la cepa 82.139 de Agrobacterium tumefaciens. Durante el proceso de infección, el transgén reportero codificante para la subunidad A de la glucuronidasa (gusA) fue detectado en los tumores inducidos por la bacteria. Sin embargo, ni los brotes y raíces regenerados, ni las plantas obtenidas resultaron transformadas. Posteriormente, este mismo grupo de investigadores publicó un sistema de transformación mediado por A. tumefaciens en esta misma especie, pero esta vez utilizando las cepas EHA105 y AGL1 que contenían el transgén reportero gusA y genes marcadores de selección. En esta ocasión, una vez más los explantes de partida utilizados fueron discos de hojas de plantas cultivadas in vitro y se empleó acetosiringona como estimulante de la virulencia de Agrobacterium en las fase de cocultivo (Sales et al., 2003). Dicho sistema de transformación fue utilizado para obtener plantas de D. minor que sobreexpresaban el dominio catalítico de HMGCoA reductasa de A. thaliana (Sales et al., 2007). Algunas de las líneas obtenidas presentaron un mayor contenido de cardenólidos (hasta un 40%) tanto in vitro como en condiciones de invernadero. Sin embargo, los efectos pleiotrópicos de esta enzima sobre el metabolismo esteroideo ponen en duda su aplicabilidad en la transformación de otras especies del género.

En D. lanata, Lehmann et al. (1995) desarrollaron un protocolo de transformación de discos de hojas por infección con Agrobacterium tumefaciens, mientras que dos años más tarde este mismo grupo logró la transformación de esta planta a partir del mismo tipo de explante pero a través de la infección con Agrobacterium rhizogenes (Pradel et al., 1997). Sin embargo, hasta el momento no se ha descrito la transformación de D. lanata con ningún gen de interés en la biosíntesis de cardenólidos.

En cuanto a D. purpurea, ya en 1990 Saito y colaboradores lograron la transferencia de un vector T al genoma de esta especie a través de la transformación de discos de hojas de la planta con la bacteria A. rhizogenes. Esta bacteria es capaz de inducir la rizogénesis por lo que estos investigadores lograron la generación y el cultivo de raíces transgénicas, sin embargo, no lograron la regeneración de plantas transformadas a partir de estas (Saito et al., 1990).

Selección de nuevos genes candidatos para transformación de Digitalis

La selección de genes candidatos para la transformación genética no es una tarea fácil. El análisis de la siempre creciente cantidad de datos biológicos generados en la actualidad ha revelado una relación compleja entre los diferentes loci y los caracteres fenotípicos, de manera que varios loci pueden tener diferentes grados de influencia en cada carácter (Mcmullen et al., 1998). Esta realidad ha impulsado el desarrollo de enfoques que abarcan diferentes fuentes de datos para resolver el problema, como la búsqueda de genes candidatos para la caracterización de loci con influencia fenotípica cuantitativa (QTL, del inglés: quantitative trait loci) (Pflieger et al., 2001). Este tipo de enfoques, sin embargo, requieren de un volumen de datos genómicos y/o fenotípicos con los que no se cuenta por el momento para las especies de Digitalis en relación con su producción de cardenólidos. La selección del candidato óptimo para obtener plantas transformadas altamente productivas debe basarse, por lo tanto, en la información existente sobre los pocos genes conocidos que influyen en las rutas de biosíntesis y degradación de estos metabolitos.

Ya ha sido referido que la mayoría de los autores coinciden en señalar a la actividad Progesterona 5-â-reductasa como el paso clave de la ruta de biosíntesis, por lo que en principio un gen codificante para esta enzima sería el candidato más promisorio a sobreexpresar en alguna de estas especies para aumentar su productividad. Sin embargo, la existencia de al menos dos isoformas de este gen con funciones presuntamente diferentes genera dudas sobre los efectos que su sobreexpresión podría traer.

La función del ortólogo de esta pareja de genes en A. thaliana fue descrita hace años como ‘influencia en el patrón de venación’ debido al fenotipo anormal mostrado por una línea mutante de este gen (locus At4g24220), denominado entonces vep1 (del inglés Vein patterning 1) (Jun et al., 2002). Posteriormente, Herl et al. (2009) demostraron que vep1 en efecto codifica una proteína con actividad progesterona 5-â reductasa. Es posible, por lo tanto, que alguno de los dos ortólogos de Digitalis (p5âr y p5âr2) tenga también influencia en la morfogénesis u otro proceso fisiológico, y su sobreexpresión pueda traer consigo alguna alteración fisiológica no deseable. Esta hipótesis es, además, soportada por el hecho de que estos dos genes tienen patrones de expresión diferentes: p5âr aparece como constitutivo ante diversas condiciones de estrés mientras que p5âr2 presenta una expresión basal mínima y es altamente inducido por etileno y H2O2 (Pérez-Bermúdez et al., 2010). Además, la expresión de p5âr2 está directamente correlacionada con los niveles de cardenólidos, a diferencia de p5âr. En consecuencia, estos autores proponen que p5âr pudiera tener otras funciones fisiológicas mientras que p5âr2 sería el responsable de la producción de glicósidos.

La manipulación de las señales de expresión de este último gen con miras a amplificar su perfil de expresión inducible parece ser, por tanto, una estrategia interesante para ser utilizada en la transformación de Digitalis. La producción de cardenólidos en las plantas resultantes podría ser incrementada, especialmente in vitro, mediante la regulación precisa de las condiciones de cultivo. Esto podría ser posible mediante el desarrollo de estrategias de producción en dos etapas, que comprendan primero la producción de biomasa vegetal y luego la inducción de la biosíntesis de cardenólidos.

CONCLUSIONES

Las plantas del género Digitalis ofrecen grandes potencialidades para la aplicación de técnicas biotecnológicas con el fin de incrementar la producción de cardenólidos y su uso en la industria farmacéutica. La existencia de protocolos de transformación genética en especies del género y los avances en este sentido en otras apuntan al uso de esta estrategia de mejoramiento. Sin embargo, la información concerniente a los genes candidatos es aún incompleta. En este sentido, parece promisoria la transformación con uno de los genes codificantes para la progesterona 5-â reductasa, aunque se requieren estudios funcionales de estos genes para determinar bajo qué señales regulatorias debe ubicarse el transgén y qué efectos sobre la viabilidad de la planta podría traer su sobreexpresión. A pesar de esto la manipulación de la expresión de p5âr2, especialmente mediante la composición del medio de cultivo in vitro, parece una estrategia interesante para maximizar la biosíntesis de cardenólidos previa producción de biomasa vegetal.

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