Vol.9, No.2, 2009.pmd 
Reseña Científica                                                                                    Biotecnología Vegetal Vol. 9, No. 2: 67 - 90, abril - junio, 2009
ISSN 1609-1841 (Versión impresa)
ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)

Identificación y selección de híbridos somáticos obtenidos mediante fusión de protoplastos

Wayner Montero-Carmona1 y Víctor M. Jiménez2*. *Autor para correspondencia.

1Centro de Investigación y Desarrollo Agrícola Sostenible para el Trópico Húmedo, Escuela de Agronomía, Instituto Tecnológico de Costa Rica, Sede Regional San Carlos, Costa Rica.

2Centro para Investigaciones en Granos y Semillas (CIGRAS), Universidad de Costa Rica, 2060 San Pedro, Costa Rica. e-mail: victor.jimenez@ucr.ac.cr

RESUMEN

El poder seleccionar eficientemente las plantas híbridas producidas a partir de fusión de protoplastos es fundamental. Se han logrado muchos avances en el tema en las últimas décadas. Entre los métodos utilizados para la identificación de híbridos somáticos se encuentran la selección por características morfológicas (tipo de crecimiento, tipo de hoja, tallo, flor o fruto, color de la flor o tipo de inflorescencia), la selección mediante micromanipulación (o manual), la citometría de flujo, la complementación, el conteo de cromosomas, la detección por isoenzimas y la utilización de marcadores moleculares, tales como el polimorfismo mediante amplificación al azar o RAPD, la hibridación genómica in situ (GISH), las secuencias repetitivas simples (SSR) o microsatélites, las secuencias intergénicas repetitivas simples (ISSR), los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y los polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP). También, el análisis isoenzimático ha sido uno de los métodos de selección más utilizados por muchos años. Aunque las técnicas moleculares basadas en el ADN se han convertido en métodos confiables para la detección de híbridos somáticos, la citometría de flujo ofrece la alternativa más rápida y sensible para la selección de las células híbridas. No obstante, los equipos necesarios para su aplicación son de un precio muy elevado. La aplicación de más de un método de detección temprana de híbridos somáticos permite aumentar la eficiencia en su selección. En esta reseña bibliográfica se describen los métodos más utilizados para la detección de híbridos somáticos y se hace un listado exaustivo, con ejemplos de su utilización a partir de 1974.

Palabras clave: isoenzimas, técnicas moleculares

ABSTRACT

Efficient selection of hybrid plants produced by protoplast fusion is very important. Several advances have been made on the subject in recent decades. The methods used for the identification of somatic hybrids include selection by morphological characteristics (growth, leaf, stem, flower or fruit type, flower color or type of inflorescence), micromanipulation (or manual selection), flow cytometry, complementation, chromosome counting, isozyme detection and the use of molecular markers, such as random amplification of polymorphic DNA (RAPD), genomic in situ hybridization (GISH), simple sequence repeats or microsatellites (SSR), the inter-simple sequence repeats (ISSR), restriction fragment length polymorphisms (RFLP) and amplified fragment length polymorphisms (AFLP). Isozyme analysis was a very common selection method for many years. Although, molecular techniques based on DNA have become reliable methods to detect somatic hybrids. Flow cytometry offers a more rapid and sensitive method for the selection of hybrid cells. However, the equipment needed for its implementation is very expensive. Use of more than one method for early detection of somatic hybrids increases the selection efficiency. This review describes the methods used for detection of somatic hybrids and presents a list of examples on their use from 1974 on.

Key words: isozymes, molecular techniques

Contenido

INTRODUCCIÓN

MÉTODOS PARA LA SELECCIÓN DE HÍBRIDOS SOMÁTICOS

- Selección morfológica

- Selección manual

- Citometría de flujo

- Complementación

- Conteo de cromosomas

- Isoenzimas

- Marcadores moleculares de ácido desoxirribonucleico (ADN) CONSIDERACIONES FINALES

INTRODUCCIÓN

La hibridación de plantas por medio de la fusión de protoplastos es una herramienta con gran potencial para la generación de nuevas combinaciones genéticas entre especies sexualmente incompatibles (Cocking, 1979; Li et al., 2004; Liu et al., 2005; Geerts et al., 2008). Esta fue referida por primera vez en 1972 por Carlson y colaboradores (Pauls, 2005). Los híbridos somáticos son producto de la fusión química o eléctrica de protoplastos (Bengochea y Dodds, 1987). Durante esta se da la coexistencia inicial de dos núcleos y de los citoplasmas pertenecientes a las dos células somáticas fusionadas, que genera una etapa de heterocariosis. Si se da la fusión de los núcleos durante la mitosis, entonces la producción de células híbridas está completa. Los productos de una fusión simétrica (ambos genomas se fusionan) presentan características complementarias entre los padres o donadores (Sakomoto y Taguchi, 1991; Kirti et al., 1992ab).

Debido a la presencia de dos núcleos en una misma célula, ocurre un cierto grado de inestabilidad que puede causar la pérdida total o parcial de uno de los genomas. Las plantas regeneradas en este tipo de eventos suelen parecerse más a uno de los donantes (Binding et al., 1988; Fahleson et al., 1988ab; Wijbrandi et al., 1990a; Lindsay et al., 1995; Navrátilová, 2004). Muchas veces, cuando ocurre pérdida de un cromosoma, también otros se pierden con gran rapidez. Cuando se eliminan todos los cromosomas de uno de los donantes, se forman cíbridos (mezcla de los citoplasmas de ambos donadores pero con solo el núcleo de uno de los dos parentales). También se pueden formar cíbridos cuando ocurre división de células heterocariontes que no han intercambiado su contenido nuclear, o bien inactivando el genoma nuclear de uno de los donantes con rayos X o rayos ganma, produciendo así colonias que exhiben las características nucleares de uno de los protoplastos parentales pero con organelas de ambos (Blackhall et al., 1994; Navrátilová, 2004).

Un aspecto crítico para el uso efectivo de la hibridación somática es la selección de los fusionantes (Blackhall et al., 1994). La tasa de fusión en un evento típico es muy baja. Aproximadamente 1-2% de fusionantes pueden ser obtenidos durante el proceso de fusión de protoplastos, los cuales, al colocarse en condiciones de selección apropiadas, pueden ser identificados y seleccionados (Cocking, 1979; Lindsay et al., 1995).

Se han publicado numerosos trabajos relacionados con la identificación y caracterización de híbridos somáticos provenientes de fusiones intraespecíficas, interespecíficas e intergenéricas, particularmente en las familias Solanaceae, Umbelliferae, Fabaceae, Poaceae, Rutaceae, Leguminoseae y Brassicaceae (Grosser y Gmitter, 1990; Wolters et al., 1994; Waara y Glimelius, 1995; Guo et al., 2004); sin embargo, no hay una revisión de literatura reciente específica sobre el tema de selección e identificación de híbridos somáticos. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue presentar, en forma resumida, una recopilación de los principales métodos de selección e identificación de híbridos somáticos publicados en la literatura científica, relacionándolos con los casos particulares en que fueron utilizados.

MÉTODOS PARA LA SELECCIÓN DE HÍBRIDOS SOMÁTICOS

La caracterización de híbridos somáticos se ha realizado mediante indicadores morfológícos, selección manual, complementación, conteo de cromosomas y pruebas bioquímicas o moleculares (Blackhall et al., 1994).

Selección morfológica

La selección morfológica se basa en la detección de variaciones fenotípicas en el híbrido somático al compararlo con los progenitores (Lindsay et al., 1995; Cheng et al., 2004). Algunas características, como el tipo de crecimiento (tallo erecto, tallo rastrero o semirastrero) y color de la flor, han sido utilizadas para este fin (Mendis et al., 1991). Por otro lado, en la fusión de tomate (Lycopersicon spp.) y papa (Solanum tuberosum L.), Lindsay et al. (1995) evaluaron características tales como la forma, el tamaño y los tipos de tricomas, así como la pigmentación de hojas, tallos y flores. Iwamoto et al. (2007), por su parte, evaluaron características, como: altura, diámetro del tallo, tipo de hoja, color de la flor, tipo de inflorescencia y peso seco de la raíz, en fusionantes de Solanum. Fenotípicamente, dichas plantas presentaron un desarrollo intermedio al de los parentales. El tipo de hoja ha permitido, también, la identificación de híbridos somáticos en cítricos (Grosser et al., 1992ab; Tusa et al., 1992). Además, fusionantes de Lotus corniculatus con L. tenuis fueron caracterizados mediante su patrón de crecimiento, tipo de hoja y color de flor (Aziz et al., 1990).

La identificación morfológica, sin involucrar otro tipo de marcador, tiene el problema de que es necesario cultivar la mayor cantidad de plantas posible, junto con los parentales, durante un período de tiempo considerable, hasta que las características se manifiesten, para luego realizar la selección al comparar los fenotipos. La selección en etapas tempranas de desarrollo, por medio de metodologías que no requieran la regeneración de gran cantidad plantas que luego serán desechadas, evita, en gran medida, esta problemática (Hammatt et al., 1990).

Selección manual

La selección manual (o micromanipulación) de los productos de fusión se utiliza cuando las dos poblaciones de protoplastos parentales pueden ser identificadas fácilmente. Esto facilita la selección de los heterocariones y de los protoplastos fusionados. Uno de los prerrequisitos para el aislamiento manual y posterior cultivo de únicamente los heterocariontes es la posibilidad de reconocerlos fácilmente y de distinguirlos de los homocariontes (fusionantes entre protoplastos del mismo donador) (Patnaik et al., 1982). Mendis et al. (1991) mencionan que el ejemplo típico de este procedimiento es la fusión entre protoplastos de mesófilo de hoja (de coloración verde por la presencia de clorofila) con protoplastos obtenidos de suspensiones celulares cultivadas en oscuridad (incoloros, debido a la presencia de protoplastidios y leucoplastos).

Cuando se fusionan protoplastos que tienen características similares (fusión entre protoplastos de mesófilo o entre protoplastos provenientes de suspensiones celulares sin color, por ejemplo) resulta de gran utilidad la tinción con fluorescencia (Patnaik et al., 1982). Para ello, los protoplastos de uno de los parentales son marcados con fluorescencia verde mediante diacetato de fluoresceína (1-20 mgl-1), y luego se fusionan con los protoplastos del otro parental, el cual produce fluorescencia roja por autofluorescencia de la clorofila (Patnaik et al., 1982; Gilmour et al., 1987; Mendis et al., 1991; Navrátilová 2004), o bien mediante tratamiento con isotiocianato de rodamina, rodamina 123 o escopoletina (10-20 mgl-1) (Barsby et al., 1984). La fluorescencia presentada por los fusionantes puede persistir en las células híbridas hasta 12 días, lo que facilita la selección de las colonias de heterocariontes e híbridos somáticos en las primeras etapas de desarrollo (Patnaik et al., 1982; Gilmour et al., 1989).

Al estudiar la eficiencia del polietilenglicol (PEG) en la fusión de protoplastos, Kao y colaboradores obtuvieron fusionantes de cebada (Hordeum vulgare Lin) y soya (Glycine max), así como de maíz (Zea mays) y soya. En ambos casos se logró la selección de los híbridos somáticos mediante micromanipulación de los fusionantes entre células verdes de mesófilo y células incoloras de suspensiones celulares (Kao y Michayluk, 1974; Kao et al., 1974). Igualmente, la presencia de antocianinas en protoplastos de hipocótilos de Corchorus olitorius (yute) fue utilizada para la selección manual de fusionantes con protoplastos verdes de cotiledones de Corchorus capsularis (Saha et al., 2001).

Aunque la micromanipulación individual de los fusionantes consume mucho tiempo y es tediosa (Blackhall et al., 1994; Navrátilová 2004), es el método más directo para la selección de los productos de fusión. Además, permite la extracción de híbridos aun cuando su porcentaje sea muy bajo, inclusive menor de 1% (Patnaik et al., 1982; Gilmour et al., 1989), lo que lo convierte en un método muy confiable (Mendis et al., 1991).

Para la correcta selección manual de los fusionantes se requiere de un microscopio óptico invertido con, al menos, un micromanipulador, así como de accesorios para epifluorescencia cuando se usan tintes fluorescentes (Patnaik et al., 1982). Dichos equipos tienen un alto costo y requieren del desarrollo de pericia para su utilización, por lo que la selección manual, en muchos casos, depende de su disponibilidad y de la habilidad del personal de laboratorio. Otro inconveniente que puede presentar esta metodología es que la intensidad de la fluorescencia de los compuestos puede variar entre células del mismo donador, lo cual puede generar problemas durante la identificación de algunos heterocariontes (Ozias-Akins et al., 1986).

Citometría de flujo

La citometría de flujo se basa en la medición de la refracción de la luz al pasar por un fluido (Eeckhaut et al., 2005). Para ello, se utiliza el sistema de fluorescencia con el marcaje de ambas poblaciones de protoplastos parentales, descrito antes. En un citómetro de flujo, las células resultantes de un experimento de fusión son transportadas en un flujo líquido entre una fuente de luz y un detector de fluorescencia. La corriente de flujo es reducida y dispersada en gotas, permitiendo que una computadora separe electrostáticamente las gotas que contienen híbridos somáticos (Harkins y Galbraith, 1984). Este proceso es completamente automático y rápido, por lo que aproximadamente 12 000 protoplastos pueden ser analizados y separados por minuto (Blackhall et al., 1994).

Ejemplos exitosos de selección con este método se han obtenido en la fusión de tomate con papa (Lindsay et al., 1995), trigo (Triticum aestivum) con maíz (Göntér et al., 2002) y Hordeum vulgare con Datura inoxia (Alexander et al., 1985). Esta técnica se recomienda cuando se logra aislar y fusionar concentraciones altas (superiores a los 5 x 107 protoplastos ml-1) de protoplastos parentales (Blackhall et al., 1994).

Sin embargo, el equipo necesario es bastante costoso y tasas de fusión menores del 10% afectan negativamente la efectividad de la técnica. Además, las técnicas químicas de fusión provocan a veces la formación de seudo-heterocariontes (protoplastos marcados con fluorescencia a los cuales de les adhirió en la plasmalema cloroplastos libres por la ruptura de otros protoplastos o protoplastos de ambos tipos adheridos uno al otro sin fusionarse) los cuales pueden dar falsos positivos en el citómetro de flujo. En la electrofusión la cantidad de seudo-protoplastos es mínima, por lo cual la citometría de flujo es ampliamente recomendada (Hammatt et al., 1990).

Otro factor a considerar es el flujo de la solución, el cual debe ser ajustado apropiadamente debido a que la velocidad de paso puede afectar la eficiencia de la técnica para detectar fusionantes. Por lo general, flujos bajos (100-200 gotas por segundo) permiten una buena detección y separación (Afonso et al., 1985; Hammatt et al., 1990). También, los cloroplastos pueden presentar niveles mínimos de fluorescencia roja o verde (aún cuando estén teñidos con colorantes fluorescentes) lo que dificulta la selección automatizada utilizando el citómetro de flujo en algunos eventos de fusión.

Complementación

La complementación se basa en la incapacidad de los protoplastos parentales (o donadores) de poder regenerar plantas completas bajo ciertas condiciones de cultivo. No obstante, y por complementariedad, los fusionantes adquieren la capacidad de sobrevivir en las condiciones seleccionadas y regenerar plantas (Cocking et al., 1977; Göntér et al., 2002). Durante la preparación de los protoplastos se debe realizar una selección minuciosa de las características de complementariedad a utilizar, algunas de las cuales también pueden ser inducidas. Posterior a la fusión, y si la complementación se da, el desarrollo de células híbridas da lugar al crecimiento de plantas. En algunos casos, las especies parentales que, en teoría, no deberían crecer en las condiciones de cultivo restrictivas, forman colonias celulares. Estas colonias, sin embargo, no llegan a regenerar plantas en las condiciones restrictivas, por lo que se pueden seleccionar fácilmente. Este método de selección permite la detección de híbridos somáticos en estadios tempranos del desarrollo (Cocking et al., 1977).

En los protocolos publicados se ha utilizado complementación de medios de cultivo (Power et al., 1976; Smith et al., 1976; Sakomoto y Taguchi 1991; Göntér et al., 2002), así como el uso de mutantes bioquímicos con autotrofía o auxotrofía hormonal, resistencia a antibióticos o a toxinas, o con la capacidad de metabolizar aminoácidos análogos (Power et al., 1976; Maliga et al., 1977; Glimelius et al., 1978; Menczel et al., 1978; Potrykus et al., 1984; Aziz et al., 1990; Mendis et al., 1991). En la figura 1 se presenta un esquema que ejemplifica el proceso de selección mediante complementación.

Polgar et al. (1999) lograron identificar fusionantes de Solanum tuberosum con Solanum brevidens mediante la resistencia a Erwinia carotovora var. carotovora presente en los protoplastos de la primera especie y la incapacidad de S. brevidens de desarrollar colonias multicelulares en el medio de cultivo con extracto de la bacteria. En fusionantes de Solanum bulbocastanum con S. tuberosum, Helgeson et al. (1998) utilizaron la resistencia a Phytophthora infestans presente en S. bulbocastanum para la selección de híbridos somáticos. La selección de híbridos somáticos mediante sensibilidad de los padres a aminoácidos análogos, como S(2-aminoetil)-L-cisteina (AEC) y DL-5-metiltriptófano (5MT), fue informada por primera vez por White y Vasil (1979). Tabaeizadeh et al. (1986) utilizaron AEC en protoplastos de Pennisetum americanum para la complementación con protoplastos de caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido) inactivados mediante iodoacetato. También la resistencia al ácido acetidin-2-carboxílico, junto con tratamientos con acetato de yodo, han mostrado ser útiles para la selección de híbridos somáticos de zanahoria (Daucus carota) mediantesensibilidad de los padres a aminoácidos análogos, como S(2-aminoetil)-L-cisteina (AEC) y DL- 5-metiltriptófano (5MT), fue informada por primera vez por White y Vasil (1979). Tabaeizadeh et al. (1986) utilizaron AEC en protoplastos de Pennisetum americanum para la complementación con protoplastos de caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido) inactivados mediante iodoacetato. También la resistencia al ácido acetidin-2-carboxílico, junto con tratamientos con acetato de yodo, han mostrado ser útiles para la selección de híbridos somáticos de zanahoria (Daucus carota) mediante complementación (Cella et al., 1983).

La utilización de mutantes albinos también ha sido exitosa para la selección de fusionantes identificados por su capacidad para producir clorofila en presencia de luz (Cocking et al., 1977; Menczel et al., 1978; Gilmour et al., 1989). El primer ejemplo de complementación mediante el uso de protoplastos albinos fue informado por Giles (1972). El proceso se basa en la regeneración de híbridos somáticos de color verde a partir de donantes albinos y donantes (con clorofila) incapaces de desarrollarse en el medio de cultivo usado (Mendis et al., 1991; Göntér et al., 2002).

Uno de los principales problemas para el uso de la complementación de protoplastos para la selección de híbridos es la falta de mutantes que permita la selección (Patnaik et al., 1982). Además, la aplicación de aminoácidos análogos en concentraciones relativamente altas puede ocasionar problemas en la regeneración de los híbridos somáticos, y reducir su desarrollo (Ozias-Akins et al., 1986).

Conteo de cromosomas

El número de cromosomas de los híbridos somáticos simétricos debe ser el resultado de la suma del número cromosómico de los donadores (Kao, 1977; Evans, 1983; Li et al., 2004). Sin embargo, como se mencionó anteriormente, con frecuencia se forman híbridos asimétricos durante la división celular, ya que el genoma de alguno de los donantes puede ser eliminado parcial o totalmente (Smith et al., 1976; McGrath et al., 1996; Göntér et al., 2002; Li et al., 2004; Iwamoto et al., 2007).

Híbridos somáticos obtenidos mediante fusión entre zanahoria y cebada fueron caracterizados mediante conteo de cromosomas por Dudits et al. (1977). En híbridos de arroz (Oryza sativa L.) con zanahoria, se observó que gran parte del genoma de arroz fue eliminado (Sala et al., 1985). Igualmente, híbridos somáticos entre varias especies de Medicago presentaron conteos superiores a los de los donadores; no obstante, ninguno de los casos mostró la sumatoria de los cromosomas de los parentales, lo cual indica que ocurrió pérdida de algunos cromosomas (Mendis et al., 1991).

Una desventaja del uso del conteo de cromosomas es que, con mucha frecuencia, se utilizan puntas de raíces en crecimiento activo para hacer las evaluaciones. Por ello, hay que esperar a que los regenerantes lleguen a esa etapa para realizar la selección, con la consiguiente pérdida en tiempo y de recursos invertidos en plantas que luego deben ser desechadas.

Isoenzimas

La detección de híbridos somáticos por patrones de isoenzimas ha sido, quizá, una de las pruebas más utilizadas para la caracterización de fusionantes, debido a que en los productos de fusión simétrica y complementaria deberían estar presentes las isoenzimas de ambos donantes, lo cual se puede evidenciar en un gel de almidón o poliacrilamida si tienen diferente movilidad electroforética (O´Conell y Hanson, 1985). Las isoenzimas heterodiméricas tienden a ser más utilizadas en la caracterización de fusionantes debido a que pueden representar más de una región del genoma (Ozias-Akins et al., 1986).

El análisis isoenzimático de shiquimato deshidrogenasas, isocitrato deshidrogenasas y fosfoglucomutasas permitió la identificación de híbridos somáticos en solanáceas (Iwamoto et al., 2007). En cítricos, la detección isoenzimática se ha realizado mediante peroxidasas, fosfoglucomutasas (Grosser et al., 1992a), fosfoglucosa isomerasas (Grosser et al., 1992b; Louzada et al., 1992) y fosfoglucano deshidrogenasas (Tusa et al., 1992).

Li et al. (2004) lograron seleccionar híbridos somáticos de Triticum aestivum con Psathyrostachys juncea (Fisch.) Nevski mediante análisis isoenzimático de peroxidasas. Mientras que Gilmour et al. (1987) utilizaron la identificación isoenzimática de esterasas y leucin-aminopeptidasas para la selección de células híbridas entre especies de Medicago. En híbridos somáticos de lotus (Lotus corniculatus + L. tenuis), la caracterización isoenzimática se realizó mediante esterasas, peroxidasas, fosfoglucomutasas, fosfatasas ácidas, malato deshidrogenasas, alcohol deshidrogenasas y la actividad de leucin-aminopeptidasas (Aziz et al., 1990).

Para híbridos entre papa y tomate se evaluaron diez isoenzimas diferentes, de las cuales glucosa-fosfato isomerasas, fosfoglucomutasas y esterasas mostraron polimorfismo en las bandas provenientes de los parentales (Lindsay et al., 1995). Sin embargo, en Pennisetum americanum + Panicum maximun, solo las isoenzimas de alcohol deshidrogenasa, aminopeptidasa, shiquimato deshidrogenasa y fosfoglucano deshidrogenasa permitieron la identificación de híbridos somáticos (Ozias-Akins et al., 1986).

Menczel et al. (1978) informaron que en Nicotiana knightiana + N. sylvestris, isoenzimas de esterasa y alcohol deshidrogenasa permitieron la caracterización de híbridos somáticos. Por su parte, para el híbrido obtenido entre caña de azúcar y Pennisetum americanum, la fosfoglucano deshidrogenasa presentó las bandas provenientes de ambos padres (Tabaeizadeh et al., 1986). También, fusionantes de Nicotiana tabacum + N. glutinosa fueron identificados con isoenzimas de peroxidasa, leucin-aminopeptidasa, glutamato-oxaloacetato transaminasa y ribulosa bifosfato carboxilasa (Horn et al., 1983).

En yute (Corchorus capsularis + Corchorus olitorius), el uso de peroxidasas facilitó la identificación de fusionantes (Saha et al., 2001). Igualmente, híbridos somáticos de Triticum aestivum con Agropyron elongatum presentaron bandas de esterasas y peroxidasas provenientes de ambos parentales (Cheng et al., 2004).

Marcadores moleculares de ácido desoxirribonucleico (ADN)

A partir de inicios de la década de 1990, las técnicas moleculares basadas en ADN (tales como los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), los polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados o AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), la amplificación aleatoria del ADN polimórfico o RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), las secuencias repetitivas simples SSR (Simple Sequence Repeat) or Microsatellite) o microsatélites y la hibridación genómica in situ o GISH (Genomic in situ Hybridization) se han convertido en métodos rápidos para la detección de híbridos somáticos (Baird et al., 1992; Xu et al., 1993; Li et al., 2004).

Los AFLPs han sido utilizados con resultados satisfactorios en varias especies. Por ejemplo, los RFLPs, obtenidos mediante las enzimas de restricción XbaI y EcoRI, confirmaron la presencia de secuencias homólogas provenientes de los dos parentales (Pennisetum americanum y Panicum maximum) en el ADN del híbrido somático (Ozias-Akins et al., 1986). De igual manera, RFLPs, utilizando las enzimas de restricción BamHI, DraI, EcoRI, EcoRV, HindIII y XbaI, fueron utilizados para la selección de fusionantes de Solanum acaule + Solanum tuberosum (Yamada et al., 1998).

En Nicotiana glauca + N. langsdorfii, se utilizaron las enzimas de restricción AccI, AvaI, BamHI, EcoRI, HindIII, HpaII, KpnI, SalI, SmaI, de caña de azúcar + Pennisetum americanum Sau961, XbaI y XhoI para la detección de híbridos somáticos (Uchimiya et al., 1983) y la enzima de restricción XbaI mostró ser una herramienta importante en la selección, mediante RFLPs, de híbridos con ADN ribosomal (Tabaeizadeh et al., 1986). Otros autores, como Saul y Potrykus (1984) han realizado análisis mediante RFLPs con la enzima de restricción HindIII que permitieron la detección de híbridos somáticos entre Hyoscyamus muticus y Nicotiana tabacum. Igualmente, en Brassica juncea y Moricandia arvensis (Kirti et al., 1992a) y Trachystoma ballii con Brassica juncea (Kirti et al., 1992b).

En híbridos de Solanum tuberosum + S. brevidens, análisis mediante RFLPs (con las enzimas de restricción EcoRI, EcoRV, BamHI, DraI y HindIII) de la progenie obtenida permitieron la detección de híbridos somáticos (Pehu et al., 1989, Fehér et al., 1992, Williams et al., 1993). De igual manera, en fusionantes de Diospyros glandulosa con D. kaki, Tamura et al. (1998) emplearon la enzima de restricción StyI para la detección y caracterización de híbridos somáticos. También en menta, se emplearon las enzimas ApaI y SteI para la detección de híbridos somáticos mediante RFLP (Krasnyanski et al., 1998).

Por su parte, AFLPs también han sido utilizados para la detección de híbridos somáticos en tomate (Thieme et al., 2008), Allium ampeloprasum con A. cepa (Buiteveld et al., 1998), Cucumis melo con C. anguria var. longipes (Dabauza et al., 1998), Oryza sativa con Daucus carota (Kisaka et al., 1994) y Daucus carota con Nicotiana tabacum (Kisaka y Kameya, 1994).

Los análisis mediante RAPDs han sido importantes para la evaluación de fusionantes intra e interespecíficos en papa (Polgar et al., 1999). RAPDs también han permitido la identificación de híbridos somáticos en trigo + maíz (Göntér et al., 2002). Esta técnica ha sido utilizada, adicionalmente, para la evaluación de fusionantes entre Solanum tuberosum y S. brevidens (Baird et al., 1992; Xu et al., 1993; Rokka et al., 1994), así como sus progenies obtenidas de retrocrusas (McGrath et al., 1994, 1996). RAPDs y RFLPs (con las enzimas de restricción HindIII y BamHI) permitieron la selección de híbridos somáticos en productos de fusión de trigo con Agropyron elongatum (Cheng et al., 2004).

Por otro lado, los SSR han sido utilizados para la detección de híbridos somáticos de Triticum aestivum + Psathyrostachys juncea (Fisch.) Nevski (Li et al., 2004). Los microsatélites son de tipo codominante lo que, a diferencia de los RAPDs y los RFLPs, permite la identificación simultánea de ambos alelos de los donadores en el híbrido somático (Johnson, 1998).

Las técnicas moleculares anteriores no permiten la identificación de cromosomas completos, por lo que GISH, una técnica muy utilizada para este fin, puede proporcionar información valiosa a este nivel (Dong et al., 1999; Iwamoto et al., 2007). Pruebas mediante RAPDs y GISH permitieron la detección de híbridos somáticos entre Solanum integrifolium y S. sanitwongsei (Iwamoto et al., 2007) y entre Triticum aestivum y Psathyrostachys juncea (Li et al., 2004). Por su parte, Dong et al. (1999) demostraron que la combinación de análisis de RFLPs y GISH facilita la detección y caracterización de los cromosomas contenidos en el genoma de híbridos somáticos de papa en relación con los genomas parentales.

La tabla 1 muestra una lista de híbridos somáticos, siméticos y asimétricos, identificados mediante diferentes métodos de selección.

CONSIDERACIONES FINALES

Los programas de mejoramiento genético convencionales se limitan al intercambio genético entre especies sexualmente compatibles. Mediante la fusión de protoplastos, la información genética puede intercambiarse sobrepasando las barreras de incompatibilidad naturales. Diferentes trabajos han demostrado que los porcentajes de formación y regeneración de híbridos somáticos son bajos (Cocking 1979; Blackhall et al., 1994; Lindsay et al., 1995). El principal reto para mejorar las técnicas de

hibridación somática, además de aumentar la eficiencia de fusión, es disponer de métodos de detección que permitan una selección y caracterización rápida y eficiente de los híbridos somáticos simétricos o asimétricos (Cocking, 1979). Mediante mejoras en los procesos de identificación será posible incrementar la frecuencia de éxito.

REFERENCIAS

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