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RESEÑA BIBLIOGRÁFICA
Uso de hongos endófitos en la producción del fármaco anti-cáncer Taxol
Use of endophytic fungi in the Taxol anticancer drug production
Hebert Jair Barrales-Cureño1*, Raqueline de la Rosa Montoya2, *Autor para correspondencia
1Colegio
de Postgraduados. km 36.5 Carretera México-Texcoco, Montecillo, Texcoco,
Estado de México. CP 56 230. e-mail: barrales.hebert@colpos.mx
2Laboratorio de biología molecular. Centro Internacional del
Mejoramiento de Maíz y Trigo. CIMMYT. km 45. Carretera México-Veracruz.
El Batán, Texcoco, Estado de México, CP 56 130.
RESUMEN
El Taxol es un fármaco empleado en la quimioterapia del cáncer de seno, pulmón, ovario, próstata, hígado y en el tratamiento de la artritis reumatoide. El Taxol proviene de árboles de Taxus spp. Se encuentra en bajas concentraciones en la corteza, agujas y raíces. La producción se obtiene por síntesis química total, pero el proceso es muy costoso. La semisíntesis se obtiene a partir de precursores como 10-diacetilbaccatina y baccatina III pero presenta baja producción. Por otro lado, los procesos de cultivo in vitro de callos y células se perfilan como una buena estrategia pero con bajo rendimiento. Por lo tanto, es urgente generar la búsqueda de alternativas para la producción de este fármaco debido a la creciente demanda del Taxol y la escasez del recurso vegetal. La forma más promisoria a gran escala de producción de Taxol es mediante el uso de sistemas de fermentación de hongos in vitro. El objetivo de este trabajo fue presentar una revisión de la literatura científica actualizada sobre el uso de hongos endófitos en la producción de este compuesto anticancerígeno. Incluye la definición de los taxoides, el mecanismo de acción biológica específica del Taxol sobre las células cancerosas, las enzimas involucradas en la biosíntesis del Taxol, los métodos cuantitativos de detección de Taxol a partir de cultivo de hongos y la alternativa biotecnológica para la producción de Taxol mediante la biodisponibilidad de hongos endófitos de gran importancia biológica a partir de Taxus spp.
Palabras clave: apoptosis, biosíntesis, 10 diacetil baccatina III, taxoides, Taxol fúngico
ABSTRACT
Taxol is a drug used in the chemotherapy of breast, lung, ovarian, prostate, liver cancers, and in the treatment of rheumatoid arthritis. Taxol is obtained from Taxus spp. trees. It is found in low concentrations in the bark, needles and roots. The production is obtained by total chemical synthesis, but the process is very costly. The semi-synthesis is obtained from precursors like 10-diacetilbaccatina and baccatin III but has low production. On the other hand, the processes of in vitro culture of callus and cells are seen as a good strategy but in low yield. Therefore, it is urgent to find alternatives for the production of this drug due to the growing demand of Taxol and plant resource scarcity. The most promising way to large scale production of taxol is using in vitro fungi fermentation systems. The aim of this study was to present a review of the updated information in the scientific literature about the use of endophytic fungi in the production of this anticancer compound. We includes the definition of taxoids, the specific mechanism of biological action of Taxol on cancer cells, the enzyme involved in the biosynthesis of Taxol, quantitative methods for detection of taxol from fungi culture and the biotechnological alternative for Taxol production by bioavailability of endophytes of great biological importance from Taxus spp.
Key words: apoptosis, biosynthesis, 10-deacetylbaccatin III, fungal Taxol, toxoids
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN
TAXOL
Características
del Taxol y taxotere
Mecanismo de acción
biológico del Taxol
Biosíntesis
del Taxol y compuestos análogos
TAXOL FÚNGICO
Relación
hongo endófito-planta hospedera
Producción
de Taxol en hongos endófitos
Condiciones del
cultivo para hongos endófitos productores de Taxol
Métodos
de detección de Taxol a partir de cultivos de hongos endófitos
Efecto citotóxico
de Taxol fúngico sobre líneas celulares de cáncer
CONCLUSIONES
INTRODUCCIÓN
El Taxol es un fármaco anti-cáncer diterpénico proveniente de la corteza de árboles del tejo (Taxus spp.). El potencial de venta anualmente en el mercado farmacéutico es de más de 2 billones de dólares (Han et al., 2007). El Taxol se encuentra en bajas concentraciones en las agujas, corteza, y raíces de Taxus spp. (Gangadevi et al., 2008). Por ejemplo, se necesitan 13 500 kg de corteza de 3 000 árboles de T. brevifolia (tejo del Pacífico, la especie más productora) para obtener alrededor de 1 kg de Taxol (Xiong et al., 2013) y se requieren 2 g de Taxol para un completo régimen de tratamiento antitumoral durante varios meses en un paciente con cáncer (Nomila et al., 2012; Xiong et al., 2013).
El cáncer es una enfermedad genética celular, debido a que no responde al control normal de la mitosis, genera una progenie que hereda la cualidad de dividirse continuamente. La lesión ocurre en el genoma, y por ello se transmite a las células descendientes y a todo el organismo, proceso conocido como metástasis (Barrales et al., 2012). El Taxol presenta un amplio espectro de actividad frente a tumores sólidos y ha sido aprobado en numerosos países y prescrito mayoritariamente para distintos tipos de cáncer como: de colon (Singla et al., 2002), sarcoma de Kaposi relacionado con el VIH (Brown, 2003), artritis reumatoide, malaria, enfermedad de Alzheimer, enfermedad del riñón policístico dominante autosomal (Sreekanth et al., 2011), cáncer cervical, gástrico (Weng-Juan et al., 2011), próstata, carcinoma de cuello (Zhang et al., 2012), carcinoma de cabeza (Nejatpour et al., 2012), leucopenia, cáncer de hígado (Priyadarshini et al., 2012) y seno, pulmón, (Senthilkumar et al., 2013), ovario (Wang et al., 2013).
La demanda actual de Taxol es de 250 kg por año (Nomila et al., 2012). Por lo tanto, es urgente y deseable generar la búsqueda de fuentes alternativas para la producción de este fármaco debido a la creciente demanda del Taxol y escasez del recurso vegetal. La producción de Taxol se obtiene por métodos alternativos, por ejemplo: la síntesis química total o la purificación de los compuestos activos de Taxus, aunque es un proceso caro y complicado (Guo et al., 2006); la semisíntesis del Taxol a partir de precursores como 10-diacetilbaccatina III o baccatina III, los cuales se aíslan a partir de las agujas, fuente renovable de los árboles, pero con baja producción (Jennewein et al., 2004). Otra alternativa son los procesos de cultivo in vitro de callos y células en suspensión de Taxus, cuya ventaja es su independencia de los factores geográficos y climáticos (Hu et al., 2003; Barrales et al., 2010).
Los cultivos in vitro han sido recientemente aprobados por la FDA (del inglés, Food and Drug Administration) para el suministro de Taxol y, aunque se perfilan como una buena estrategia, los costos de la infraestructura son demasiado elevados y presentan la desventaja del bajo rendimiento. Sin embargo, la forma más prometedora a gran escala de producción de Taxol y taxoides relacionados es el uso de sistemas de fermentación de hongos in vitro (Xu et al., 2006; De Jong et al., 2006). La desventaja de producir Taxol fúngico en cultivos in vitro se ve limitado porque se atenúa con el tiempo, aunque está la posibilidad de reactivarlos mediante la adición de elicitores de tipo biótico o abiótico.
Los hongos endófitos son de gran importancia en la biotecnología como productores de compuestos farmacéuticos, metabolitos secundarios, agentes de control biológico y otras características útiles (Gangadevi et al., 2008). Los endófitos son microorganismos (hongos o bacterias) que viven en una planta sin causar síntomas de enfermedad al hospedante (Stone et al., 2000; Miller et al., 2008). Taxomyces andreanae fue la primera especie de un hongo endófito productor de Taxol a partir del Tejo del Pacífico informada en la literatura científica (Stierle et al., 1993). Todo esto evidencia a los hongos y bacterias como una fuente potencial y uno de los principales medios para la obtención y el suministro de Taxol. Por lo tanto, los procesos de fermentación que utilizan microorganismos productores de Taxol puede ser una alternativa biotecnológica promisoria para producir este compuesto.
Teniendo en cuenta los aspectos anteriores y la importancia de la obtención de Taxol, el objetivo de este trabajo estuvo dirigido a presentar una revisión de la literatura científica actualizada sobre el uso de hongos endófitos en la producción de este compuesto anticancerígeno. Incluye la definición de los taxoides, el mecanismo de acción biológica específica del Taxol sobre las células cancerosas, las enzimas involucradas en la biosíntesis del Taxol, los métodos cuantitativos de detección de Taxol a partir de cultivo de hongos y la alternativa biotecnológica para la producción de Taxol mediante la biodisponibilidad de hongos endófitos de gran importancia biológica a partir de Taxus spp.
TAXOL
Características del Taxol y taxotere
Han sido referidos cerca de 400 taxoides de varias especies de Taxus (Barrales y Soto, 2012). La estructura del Taxol se determinó por Wani et al. (1971) del Research Triangle Institute de EE.UU., como un diterpeno alcaloidal (fórmula molecular: C47H51NO14, Figura 1), con un esqueleto de taxano altamente funcionalizado (Barrales y Soto, 2012).
El proceso comenzó con el fraccionamiento de los extractos con diferentes solventes. Las pruebas de citotoxicidad directa se realizan en ensayos guiados de líneas celulares. Los taxoides varían de acuerdo con la posición de los grupos funcionales, las hidroxilaciones se llevan a cabo por citocromos P450 monooxigenasas y los componentes de la cadena lateral son modificados por el esqueleto de taxano tricíclico (Barrales et al., 2011).
El nombre genérico del Taxol es Paclitaxel, mientras que el nombre o marca comercial es Taxol®. El taxotere es un fármaco semisintético anticáncer que es utilizado en tratamiento del cáncer de mama localmente avanzado y cáncer avanzado de estómago, no es muy recomendable su uso debido a que puede originar efectos secundarios tales como neutropenia (disminución de glóbulos blancos), retención de líquidos, reacciones alérgicas, vómitos y náuseas. El nombre genérico del taxotere es docetaxel (Barrales y Soto, 2011). Tanto el Taxol como el taxotere se administran vía inyección o infusión intravenosa.
Mecanismo de acción biológico del Taxol
El Taxol promueve el ensamblaje de á-tubulina en los microtúbulos por unión preferencial a la tubulina ensamblada más que a la tubulina no ensamblada. Su efecto está relacionado con el del nucleótido guanosín trifosfato (GTP), con importantes diferencias. El GTP se une a un extremo del dímero de tubulina haciendo contacto con el siguiente dímero a lo largo de cada protofilamento que forma el microtúbulo, mientras el Taxol se une a un lado de â-tubulina cerca del contacto con el siguiente protofilamento; en la á-tubulina, la zona correspondiente a la cavidad de unión a Taxol está ocupada por un bucle de la cadena peptídica (Nogales, 2000).
Los dímeros de tubulina sin ensamblar unen GTP y el sitio de unión queda ocluido por el ensamblaje, mientras el sitio de unión a Taxol existe sólo en la tubulina ensamblada (Jordan y Wilson, 1998). La hidrólisis de GTP permite el desensamblaje y la regulación del sistema de microtúbulos, sin embargo, la activación de la tubulina por Taxol es permanente, estabilizando los microtúbulos.
La supresión de la dinámica de microtúbulos celular por Taxol es una causa principal de la inhibición de la división celular y de la muerte de las células tumorales (Jordan y Wilson, 1998).
El Taxol induce el arresto del ciclo celular e incrementa los factores de señalización (Spencer y Faulds, 1994). Además, disminuye los niveles de glucosa 1,6-bifosfato, fructosa 1,6-bifosfato y ATP en la glicólisis, mediante mecanismos específicos, al inducir una separación de la fosfofructoquinasa del citoesqueleto de células del melanoma humano (Priyadarshini et al., 2012).
Diferentes tipos de cáncer se combaten mediante tratamiento con Taxol (Singla et al., 2002; Zhang et al., 2012; Senthilkumar et al., 2013; Wang et al., 2013). Otros usos médicos son en el tratamiento de la artritis reumatoide, malaria, enfermedad de Alzheimer y enfermedad del riñón policístico dominante autosomal (Sreekanth et al., 2011).
En este sentido, en un estudio biodirigido, el uso de una formulación de Taxol basada en policarbofilo tiolado mostró que los niveles de Taxol en el plasma mejoraron significativamente y se redujo el crecimiento de los tumores malignos (Föger et al., 2008).
Biosíntesis del Taxol y compuestos análogos
Muchos pasos de la ruta de biosíntesis se han elucidado por medio del aislamiento de genes y enzimas de tejidos y cultivo in vitro de células en suspensión de Taxus. Usando herramientas moleculares, se han identificado los genes que codifican las enzima GGPP sintasa, 10 diacetil baccatina III-10-Oacetil tranferasa, taxadieno sintasa, citocromo P450 taxano 10 â-hidroxilasa, 3´-N-dibenzoil-2´-dioxiTaxol N-benzoiltranferasa, baccatina III: 3-amino-3-fenilpropanoil transferasa, taxano 13 á-hidroxilasa, taxano 2 á-O-benzoil-tranferasa y taxa-4(20),11(12)-dieno-5 á-ol-O-acetil tranferasa (Walker et al., 2000; Lenka et al., 2012).
El primer paso en la biosíntesis de Taxol es la ciclización de geranilgeranil difosfato (GGPP), el cual comienza con la formación de taxa-(4,5), (11,12)-dieno, que es el primer compuesto en la ruta biosintética del Taxol (Figura 2).
Esta reacción se cataliza por la enzima taxadieno sintasa (TS, una enzima formada por una proteína monomérica de 79 kDa con propiedades similares a otras ciclasas de terpenoides) (Barrales y Soto, 2012).
La enzima TS fue purificada y caracterizada por Hezari, Lewis y Croteau. Los genes que codifican para la taxadieno sintasa fueron identificados y clonados por Wildung y Croteau (Barrales y Soto, 2012).
La estructura genómica
de TS se presenta en la figura 3-A. Análisis posteriores de la estructura
enzimática revelaron características típicas de sintasa
de terpenoides de plantas, tales como un motivo DDXXD responsable de la unión
del cofactor, un dominio de la secuencia interna diterpeno de conífera
y una hidrolasa como dominio glicosil (Trapp y Croteau, 2001, Fig. 3-B). Para
una revisión más detallada de la biosíntesis del Taxol
y taxoides relacionados consultar: Barrales y Soto (2012).
TAXOL FÚNGICO
Relación hongo endófito-planta hospedera
Los hongos endófitos se definen como microorganismos que pasan la mayor parte o todo su ciclo de vida colonizando los tejidos de la planta hospedera, sin causar daño evidente. Son un grupo muy diverso y polifilético que habitan en diversas partes de las plantas. La mayoría pertenecen al phylum Ascomycota, aunque también se han encontrado en Basidiomycota, Zygomycota y Oomycota. La relación entre los hongos endófitos y su planta hospedera va desde el mutualismo hasta la patogénesis (Rodríguez et al., 2009). En estas relaciones ambos organismos producen metabolitos secundarios potencialmente tóxicos.
El hongo endófito produce factores de virulencia, como metabolitos fitotóxicos y exoenzimas, mientras que la planta produce sustancias involucradas en mecanismos de defensas, tanto bioquímicos como mecánicos (Schulz y Boyle, 2005).
En consecuencia, para que ambos organismos coexistan se establece entre ellos una relación de antagonismo balanceado, que depende de la virulencia del hongo y de las defensas de la planta, las cuales varían y son influenciadas por la etapa de desarrollo de ambos organismos y por los factores ambientales. Cuando los factores de virulencia del hongo y las defensas de la planta están en equilibrio se establece una relación endofítica y, por el contrario, cuando se presenta la senescencia del hospedero o se encuentra bajo estrés, el balance se torna a favor del hongo y éste se expresa como patógeno, y se presentan síntomas de enfermedad (Kusari et al, 2012).
Producción de Taxol en hongos endófitos
El Taxol es un metabolito secundario en Taxus spp., y sirve como una medida de protección o mecanismo de defensa del árbol de tipo fungicida contra el ataque de hongos ficomicetos tales como Pythium y Phytophthora, los cuales causan grandes problemas fitopatológicos en las raíces de algunas especies de plantas y compiten con los hongos endófitos por el mismo nicho ecológico (Li et al., 1996). También los hongos endófitos pueden producir compuestos activos benéficos durante la simbiosis con plantas hospedantes (Sun et al., 2008).
El Taxol y compuestos análogos han sido aislados a partir de T. chinensis, T. cuspidata, T. media, T. mairei y T. baccata (Jorgeane et al., 2011). Entre los hongos endófitos que se destacan son: Alternaria, Fusarium, Monochaetia, Periconia, Pestalotia, Pestalotiopsis, Pithomyces, Taxomyces andreanae, entre otros (Strobel, 2003).
El rendimiento de Taxol en cultivos in vitro de hongos endófitos varía de 24 a 70 ng l-1 en el medio de cultivo (Stierle et al., 1993; Strobel et al., 1996). Varios hongos endófitos producen Taxol y compuestos análogos tales como: baccatina III y 10 diacetil baccatina III (Jorgeane et al., 2011, Rahimi et al., 2013) (Figura 4).
Shrestha et al. (2001) indicaron la producción de Taxol a partir de tres diferentes hongos endófitos aislados del Tejo del Himalaya (T. wallichiana) los cuales son: Trichothecium sp., Sporormia minima y hongos dimórficos sin identificar los que fueron confirmados por diferentes métodos analíticos y de inmunoensayo (Gangadevi y Muthumary, 2007). En la tabla 1 se indican los hongos endófitos productores del fármaco Taxol.
Las concentraciones de Taxol producidas por los hongos endófitos varían de acuerdo con el género y especie fúngica así como con la especie vegetal.
Por ejemplo, el hongo endófito Fusarium mairei aislado del árbol asiático T. cuspidata tiene la mayor producción de Taxol con 6.11 mg l-1 y Gliocladium sp. la menor con 1 076 ng/200 ml. Por otra parte, el hongo endófito Stemphylium sedicola aislado del árbol europeo T. baccata tiene la mayor producción de Taxol con 6.9 ± 0.2 ìg l-1 y Nodulisporium sylviforme la menor con 0.051 a 0.01257 ìg l-1. Pestalotiopsis microspora aislado del árbol asiático T. wallichiana presenta una producción de 60 a 70 ìg l-1 mientras que Fusarium mairei aislado en China del árbol T. chinensis var. mairei produce 20 ìg l-1. Igualmente, Didymostilbe sp. aislado en China del árbol T. chinensis muestra una producción de 8 a 15 ìg l-1. Otra especie fúngica, Taxomyces andreanae aislado a partir del árbol de América del Norte T. brevifolia, produce de 0.024 a 0.025 ìg l-1 de Taxol. Autores como Noh et al. (1999) informaron que a partir del suelo de bosque de tejos un hongo endófito, Pestalotia heterocornis, produce 0.031 ìg l-1 de Taxol.
Sun et al. (2008) aislaron 155 cepas de hongos endófitos a partir de tejidos de Podocarpus. Los resultados mostraron que la cepa ETPT-1, clasificada como Aspergillus fumigatus puede ser un candidato para la producción de Taxol. También se ha obtenido Taxol de cepas de hongos endófitos de la especie Botryodiplodia theobromae (Raja et al., 2008) y de cepas aisladas de hojas de Taxus baccata, así como de Phyllosticta citricarpa de Citrus medica (Senthil et al., 2008). De igual forma se ha referido que Pestalotiopsis terminaliae aislado de la planta Terminalia arjuna (Gangadevi y Muthumary, 2009) produce la mayor cantidad de Taxol. En estudios posteriores, se encontraron otras especies de microorganismos aislados de coníferas capaces de producir Taxol tales como Periconia sp., Fusarium solani, Alternaria sp. y Aspergillus sp. (Sun et al., 2008; Liu et al., 2009), lo cual es interesante debido a que proceden de árboles de diferentes géneros y familias (Visalakchi y Muthumary, 2010).
El origen genético de la producción de Taxol fúngico se especula que se realiza mediante la transferencia horizontal de genes de la planta hospedera a sus endófitos aunque existe poca información respecto a la transferencia de genes de una planta superior a un endófito o parásito (Visalakchi y Muthumary, 2010).
Condiciones del cultivo para hongos endófitos productores de Taxol
Algunos medios de cultivo utilizados para el crecimiento fúngico son: PDA (papa-dextrosa-agar), OMA (agar harina de avena), CMA (agar harina de maíz) y el jugo V-8 (Sreekanth et al., 2011). Las características que se analizan son: temperatura óptima de crecimiento, presencia o ausencia de conidios, morfología de conidios, características de los conidióforos, color de la colonia, características morfológicas de la colonia, diámetro promedio (mm) de las colonias después de 5 días (Sreekanth et al., 2011), entre otras.
Métodos de detección de Taxol a partir de cultivos de hongos endófitos
Los métodos utilizados para la cuantificación de Taxol en extractos fúngicos son: CL-MS (Guo et al., 2006; Zhang et al., 2008), análisis espectroscópico por luz UV (Gangadevi et al., 2008), RP-HPLC (Barrales et al., 2011), cromatografía en capa fina de alta resolución, HPTLC (Barrales et al., 2011), IR, TLC (Nomila et al., 2012), espectroscopía de masas (SM) (Soliman y Raizada, 2013), 1H NMR (Soliman y Raizada, 2013), inmunoensayo mediante reconocimiento de un anticuerpo monoclonal de Taxol (Soliman y Raizada, 2013), LC-ESI-MS y MALDI.
El inmunoensayo de Taxol por inhibición competitiva, utiliza anticuerpos monoclonales antiTaxol. El inmunoensayo detecta valores superiores a 3.5 ng ml-1, es insensible a compuestos análogos tales como la cefalomanina en niveles inferiores a 60 ng ml-1 e insensible a baccatina III y 10-diacetil baccatina III por debajo de 1000 ng ml-1. El Taxol de la muestra se detecta por la inhibición competitiva que éste ejerce sobre la reacción entre el antígeno, Taxol-proteína conjugada de la fase sólida y el anticuerpo antiTaxol. El grado de inhibición, comparado con los controles desinhibidos, se observa por la intensidad de color que resulta de la adición de anti-anti-Taxol-fosfatasa alcalina conjugada y su sustrato. Diversos factores pueden afectar la reacción inmunoquímica en cada pozo de reacción, por ejemplo, las condiciones físicas externas, como la temperatura, variación en los procedimientos experimentales, diferencias en las adsorptividades de diferentes placas y en diferentes pozos de la misma placa, así como variaciones entre los reactivos estándar entre lote y lote de reactivos (Grothaus et al., 1993).
Los taxoides se detectan, además, por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) a una longitud de onda de 227 nm. La fase móvil utilizada consiste de metanol/acetonitrilo/agua (20:33:47 por volumen). La columna que se utiliza para el análisis es C18, tamaño de partícula 5 ìm y una longitud 150 mm. La tasa de elución es de 1 ml min-1. Se debe comparar con estándares del taxoide analizado (Zhang et al., 2011).
Los sistemas de solventes eficientes que se utilizan en cromatografía en capa fina para identificar cualitativamente la presencia de Taxol son: a) cloroformo/metanol (7:1 v/v), b) cloroformo/acetonitrilo (7:3 v/v), c) acetato de etilo/2-propanol (95.55 v/v) y d) cloruro de metileno/metanol/dimetilformamida (90:9:1 v/v/v).
La presencia de Taxol se detecta fácilmente con una solución al 1% (m/v) del reactivo de vainilla/ácido sulfúrico después de un suave calentamiento. La apariencia de una mancha azulada desvanecida a gris oscuro después de 24 h es indicativa de la presencia de Taxol (Gangadevi y Muthumary, 2007).
Los métodos de identificación molecular que se utilizan para confirmar la identidad de los hongos endófitos son: análisis de secuencias de rRNA 18S (Zhou et al., 2009), región del espacio transcrito interno, análisis de secuencias de rDNA 26S y análisis de secuencias conservadas ITS4-ITS5.
Efecto citotóxico de Taxol fúngico sobre líneas celulares de cáncer
Existe amplia evidencia sobre la inducción de la apoptosis en diversas células cancerosas tratadas con Taxol, tales como cáncer de mama, glioblastoma, hepatoma y cáncer de ovario. El Taxol es conocido por activar la apoptosis en las vías dependientes e independientes de caspasa (Bröker et al., 2004; Piñeiro et al., 2007).
Gangadevi y Muthumary (2007) evaluaron el efecto de la citotoxicidad de Taxol fúngico aislado de hongos endófitos sobre líneas celulares de cáncer utilizando el método de apoptosis, en un rango de concentraciones de 0.005 a 5 µM de Taxol fúngico. Los resultados indicaron que las concentraciones 0.05 y 0.5 µM de Taxol obtenido del filtrado fúngico mostró que muchas de las células fueron arrestadas durante la división celular y el núcleo celular comenzó a condensarse y a segmentarse después de 24 h de incubación, lo cual es indicio de muerte celular por apoptosis.
De igual forma,
las concentraciones de 0.05 y 0.5 µM aplicadas sobre cinco líneas
celulares ocasionaron altos porcentajes de células apoptóticas:
BT220-seno (79.6 a 81.6%), Hll6-colon humano (70.6 a 78.5%), Int407-intestino
humano (70.6 a 79.8%), HL251-pulmón humano (69.3 a 72.5) y HLK210-leucemia
humana (68.6 a 79.6%). Las células apoptóticas son fácilmente
visibles en tejidos en desarrollo y en tumores y se encuentran a bajas tasas
en tejidos adultos (Gangadevi y Muthumary, 2007). Por lo tanto, se evidenció
que la eficacia del Taxol fúngico de diferentes especies de hongos endófitos
fue totalmente dependiente del tipo específico de células.
La secuencia de los cambios sobre la morfología celular por medio de la apoptosis se resume a continuación: 1) disminución celular, 2) condensación, marginación y fragmentación de la cromatina, 3) retención de la estructura de los organelos citoplasmáticos y perdida de las interrelaciones de las posiciones de los organelos (Wyllie, 1992).
CONCLUSIONES
Los procesos de fermentación utilizando microorganismos son uno de los mejores métodos de elección por su bajo costo y el incremento de rendimientos de metabolitos naturales. La población endófita explorada de Taxus spp. representa una gran variedad de géneros de hongos y variación en la producción de Taxol. Los hongos endófitos que pueden ser utilizados para la producción de Taxol a gran escala a nivel industrial son: Fusarium mairei, Stemphylium sedicola y Pestalotiopsis microspora. Los procesos de fermentación con el uso de microorganismos productores de Taxol puede ser una alternativa conducente para producir Taxol. Las ventajas potenciales de la producción de Taxol microbiano incluyen: un rápido crecimiento del cultivo, condiciones de cultivo reproducible, alta densidad celular, fácil manipulación genética y la posibilidad de escala a nivel industrial de la producción del compuesto. Además, la producción microbiana ayuda a proteger los recursos naturales de extinción de los árboles de Taxus spp. para evitar hacer peligrar las especies. La desventaja de producir Taxol fúngico en cultivos in vitro se ve limitado porque se atenúa con el tiempo, aunque está la posibilidad de reactivarlos mediante la adición de elicitores de tipo biótico o abiótico. Los hongos endófitos pueden ser manipulados y perfilados para incrementar la producción de Taxol por medio de la ingeniería genética para comprender la forma de transformación del material genético entre la asociación del endófito y el hospedante. Se recomienda identificar la producción de Taxol en una mayor exploración de hongos endófitos de especies faltantes de Taxus o a partir de otras especies vegetales.
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Recibido: 26-12-2013
Aceptado: 11-03-2014
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