Extracción de proteínas a partir del fluido intercelular en hojas de banano, cultivar ‘Grande naine’ ( Musa  AAA)

Milady Mendoza-Rodríguez; Aminael Sánchez; Michel Leiva-Mora; Mayra Acosta-Suárez; Luis Rojas; Elio Jiménez; Orelvis Portal

Vol.6, No.1, 2006.pmd

Comunicación corta                                                                                Biotecnología Vegetal Vol. 6, No. 1: 59 - 62, enero - marzo, 2006

Extracción de proteínas a partir del fluido intercelular en hojas de banano, cultivar Grande naine (Musa AAA)

Milady Mendoza-Rodríguez , Aminael Sánchez-Rodríguez, Michel Leiva-Mora, Mayra Acosta-Suárez, Luis Rojas, Elio Jiménez, Orelvis Portal. *Autor para correspondencia.

Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP). Universidad Central Marta Abreu de Las Villas, Carretera a Camajuaní km 5 ½, Santa Clara, Villa Clara, CP 54 830, Santa Clara, Villa Clara, Cuba, e-mail: milady@ibp.co.cu

RESUMEN

La extracción y caracterización de las proteínas involucradas en los procesos de patogénesis en plantas ha sido una herramienta fundamental para el estudio de diferentes patosistemas. El estudio de las proteínas secretadas a los espacios intercelulares de las hojas, en respuesta a factores bióticos y abióticos, constituye un paso fundamental para lograr este propósito. Se realizó la extracción de proteínas intercelulares, a partir de tejido de hojas de plantas adultas, de banano Musa AAA (subgrupo Cavendish) cultivar Grande naine, sanas y enfermas con síntomas en diferentes estadios de desarrollo de la enfermedad Sigatoka negra. Fragmentos de hoja de 2 cm² se infiltraron al vacío, se centrifugaron y al recobrado obtenido se le añadió sulfato de amonio al 80% (p/v) para la precipitación de las proteínas, las que posteriormente se analizaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 12%. Se obtuvo una concentración de proteínas promedio de 0.43 mg.ml^-1 para muestras sanas y de 0.83 hasta 1.0 mg.ml^-1 en las infectadas. Los resultados constituyen el paso inicial en el estudio del patosistema Musa-Mycosphaerella fijiensis, lo que permitirá conocer acerca de las proteínas involucradas en la interacción, como aspecto esencial a tener en cuenta para el desarrollo de las futuras estrategias de resistencia a patógenos.

Palabras clave: electroforesis desnaturalizante, precipitación salina, purificación de proteínas

ABSTRACT

The extraction and characterization of proteins involved in plant pathogenesis process, has been an important tool for pathosystem study. The study of secreted proteins to intercellular space of leaves in response to biotic and abiotic factors constitutes an important step to reach this purpose. Intercellular proteins, from healthy and infected leaves tissue of banana plants Musa AAA (subgroup Cavendish) cultivar Grande naine at different stages of development of the Black Sigatoka disease were extracted. Leaves fragments of 2 cm² were infiltrated at vacuum, centrifuged and 80% (w/v) of ammonium sulphate for protein precipitation was added to the collected intercellular fluid , which were analyzed in a denaturant polyacrilamide gel at 12%. The average protein concentration obtained was 0.43 mg.ml^-1 for healthy and 0.83 until 1.0 mg.ml^-1 for infected samples from intercellular space. The results are the first step in Musa-Mycosphaerella fijiensis pathosystem study, allowing to know about the proteins involved in the interaction, as an essential aspect to take into account for the development of future strategies of resistance to pathogen.

Key words: denatured electrophoresis, protein purification, salt precipitation

INTRODUCCIÓN

Desde la aparición de la enfermedad Sigatoka negra, causada por el hongo ascomiceto Mycosphaerella fijiensis Morelet (Pseudocercospora fijiensis Morelet, anamorfo) (Crous, 2003), numerosas han sido las pérdidas en el cultivo de bananos y plátanos a nivel mundial. Sin embargo, pocas han sido las investigaciones llevadas a cabo en esta interacción, por lo que la información existente es muy limitada. Aún se desconoce el mecanismo empleado por el patógeno para infestar Musa spp., así como las interacciones específicas que ocurren durante el proceso infeccioso (Lepoivre et al., 2003; Pérez et al., 2003).

El estudio de las interacciones hospedante-patógeno, entre otros aspectos, ha estado enfocado hacia el análisis de las proteínas, que se expresan en los espacios intercelulares en la planta, como respuesta ante diferentes factores bióticos y abióticos (Stressmann et al., 2004). El fluido intercelular es parte del apoplasto de la célula y es el lugar por donde los patógenos comienzan frecuentemente la colonización de la planta y se conoce que a través de este fluido tienen lugar procesos como respuesta de defensa de la planta ante condiciones de estrés (Yu et al., 2001) y frente a microorganismos (Bolwell et al., 2002; Anand et al., 2004), que incluye la síntesis de proteínas con propiedades antimicrobianas, las cuales se secretan fundamentalmente hacia el espacio intercelular (Moy et al., 2002) así como la transmisión de señales (Xia et al., 2004). Todo este conocimiento adquirido ha sido posible por los avances logrados en la extracción y purificación de proteínas, lo que ha permitido la caracterización de las mismas, aunque solo se conocen las características y regulación de algunas como las taumatinas y quitinasas (Kasprzewska, 2003).

En el modelo Musa-Mycosphaerella fijiensis, no se tienen referencias en la literatura científica relacionada con el papel de las proteínas durante el proceso de penetración y colonización del tejido por el patógeno, por lo que existe gran desconocimiento acerca de la temática.

Estudiar las síntesis, características y regulación de las proteínas en especial de aquellas que se acumulan en el espacio intercelular, es esencial para poder entender los procesos infecciosos y de defensa que presenta la planta. Esta información podría contribuir a desarrollar estrategias novedosas para la protección de los cultivos del ataque causado por hongos, en los diferentes programas de mejoramiento genético (Tripathi, 2003; Perea et al., 2004).

Por todo lo anteriormente planteado, en el presente trabajo se realizó la extracción de proteínas intercelulares, a partir de hojas de banano Musa AAA (subgrupo Cavendish) cv. Grande naine sanas y enfermas (con síntomas en diferentes estadios de desarrollo de la enfermedad).

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se utilizaron plantas del cultivar susceptible Grande naine Musa (AAA) de 9 meses de cultivo, que se encontraban en una plantación de la estación experimental de Remedios, perteneciente al Instituto de Biotecnología de las Plantas.

Extracción del fluido intercelular

Las hojas se lavaron con agua destilada tres veces, se secaron con papel absorbente y con ayuda de un bisturí se retiró la nervadura central. Se cortaron 100 fragmentos de 2 cm² a partir de hojas sanas (control) y enfermas con más de un síntoma en los estadios 2 y 3 de desarrollo de la enfermedad Sigatoka negra según la escala propuesta por Fouré (1985). Los mismos se introdujeron en el tampón de extracción para su infiltración al vacío (100 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM ácido ascórbico, 50 mM ditiotreitol y 5 mM fenilmetilsulfonil fluoruro), por treinta minutos. Posteriormente se secaron los fragmentos con papel absorbente y se colocaron en jeringuillas de 20 ml, las cuales estaban introducidas en tubos de centrífuga de 50 ml. La recuperación del fluido intercelular fue realizada por centrifugación a 3 000 g por 10 minutos a 4 ºC. Las proteínas totales de cada muestra se precipitaron con sulfato de amonio al 80 %, durante toda la noche a 4 ºC y se recuperaron por centrifugación a 10 000 g 10 min a 4 ºC. El precipitado obtenido se lavó con el mismo porcentaje de sulfato de amonio y se resuspendió en 0.5 ml de tampón fosfato salino PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 100 mM Na₂HPO₄ y 2 mM KH₂PO₄, pH 7.4). Las muestras fueron dializadas con el mismo tampón y conservadas en un tubo eppendorf a 80 ºC hasta su utilización.

La concentración de proteínas se determinó según el método descrito por Bradford (1976). La albúmina de suero bovina (Sigma) se utilizó como patrón.

Electroforesis de proteína

Se tomaron 5 μg de proteínas totales de cada una de las muestras, para ser analizadas en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE), para ello se les añadió igual volumen de tampón de muestra 2X e incubaron a 100 ºC por 5 min. Las bandas se revelaron con tinción plata con el kit Silver Stain (Bio-Rad). Los mini geles se realizaron según el método descrito por Laemmli (1970), utilizando un gel separador al 12 % (0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 0.1 % SDS) y un gel concentrador al 4 % (0.125 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.1 % SDS). La corrida se realizó en el tampón Tris-glicina (25 mM Tris, 192 mM Glicina, 0.1 % SDS, pH 8.3), en una cámara de electroforesis Mini-PROTEAN (Bio-Rad) a voltaje constante de 200 V durante 1 hora. El tampón de muestra 2X contenía (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4.6 % (p/v) SDS, 20 % (v/v) glicerol y 0.002 % (p/v) bromofenol azul). El marcador de peso molecular empleado fue PageRuler^TM Protein Ladder (de 10 a 200 kDa) (Fermentas).

Análisis estadístico

Los datos relacionados con la concentración de proteínas de las muestras, fueron analizados mediante un ANOVA de clasificación simple y la comparación de las medias se realizó por Dunnetts C, para encontrar homogeneidad en la varianza. Para el procesamiento estadístico de los datos se empleó el software SPSS versión 13.0 para Windows.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Extracción del fluido intercelular

Se observaron diferencias significativas entre las muestras en estudio (Tabla 1). Se obtuvo un aumento de la concentración de proteínas en el estadio 3 de desarrollo de la enfermedad Sigatoka negra, al ser comparados con el estadio 2 y la muestra control. Se ha descrito que hay proteínas que se acumulan extracelularmente ante condiciones de estrés abiótico (Yu et al., 2001), biótico (Suo et al., 2002) y que las mismas incrementan su nivel proporcionalmente ante el estímulo presente (Suo et al., 2001). En el caso particular de este patosistema los resultados evidencian que existe la misma tendencia al aumento de la síntesis de proteínas a medida que se desarrollan los estados de síntomas de la enfermedad.

Electroforesis de proteína

Se obtuvo un patrón de proteínas las cuales oscilaron en un rango de peso molecular entre 10 y 40 kDa. Dentro de ellas algunas fueron diferenciales con respecto a la muestra control. Estas bandas podrían estar vinculadas con proteínas relacionadas con la patogenicidad del hongo y con la defensa en la planta. Una de las respuestas comúnmente observadas en la planta ante el ataque por un patógeno, es la síntesis de proteínas con propiedades antimicrobianas y dentro de ellas las relacionadas con la patogénesis (PR, de sus siglas en inglés pathogenesis-related proteins) son las más comúnmente encontradas (Rep et al., 2002) (Figura 1).

Con el objetivo de tener una caracterización completa de estas proteínas, se deberán realizar ensayos enzimáticos, así como electroforesis bidimensional para el análisis de los patrones de proteínas, en la medida que transcurre el proceso infeccioso.

REFERENCIAS

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