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Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 6, No. 4: 213 - 217, octubre - diciembre, 2006
Construcción y secuenciación parcial de una biblioteca sustractiva en ‘Calcutta 4’ (Musa AA) en estadio temprano de infección con Mycosphaerella fijiensis Morelet
Milady Mendoza-Rodríguez*, Aminael Sánchez-Rodríguez, Mayra Acosta-Suárez, Berkis Roque, Orelvis Portal, Elio Jiménez *Autor para correspondencia.
Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara, Villa Clara, Cuba. CP 54 830. e-mail: milady@ibp.co.cu
RESUMEN
El estudio de los genes involucrados en la respuesta de defensa en la planta contra el ataque de patógenos, es uno de los pasos más importantes para la elucidación de los mecanismos moleculares de resistencia a enfermedades. La generación de bibliotecas sustractivas de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc), por medio de la técnica de hibridación sustractiva por supresión, ha sido utilizada para este propósito. En este trabajo se realizó una hibridación sustractiva, entre el ADNc obtenido de hojas de ‘Calcutta 4’ inoculadas con M. fijiensis (CCIBP-Pf83) y una mezcla de ADNc de hojas de ‘Calcutta 4’ no inoculadas y del micelio del hongo. Las muestras de hojas se tomaron a los 6, 10 y 12 días posteriores a la inoculación. La biblioteca sustractiva se obtuvo por clonación y transformación de los productos sustraídos y como resultado se obtuvieron 600 clones recombinantes. El análisis de secuencia de 69 clones reveló redundancia de las secuencias blanco expresadas, la mayoría no mostró homología con secuencias en las bases de datos. El 13 % tuvo alta homología con metalotioninas. Los resultados constituyen un paso de avance en el estudio a nivel molecular de la interacción Musa- Mycosphaerella fijiensis.
Palabras clave: hibridación sustractiva por supresión, interacción Banano-Mycosphaerella fijiensis, Musa spp., Sigatoka negra
ABSTRACT
The study of genes involved in plant defense response against pathogen attack, is one of most important steps leading to the elucidation of disease resistance molecular mechanisms. The generation of subtracted deoxyribonucleic acid libraries (cDNA), by means of suppression subtractive hybridization technique (SSH), has been used for this purpose. A subtractive hybridization was made between a cDNA population obtained from ‘Calcutta 4’ inoculated leaves with M. fijiensis (CCIBP-Pf83) and a mixture of cDNA from ‘Calcutta 4’ non inoculated leaves and mycelium. Leaves samples were taken at 6, 10 and 12 days after inoculation. The subtracted library was obtained by cloning and transformation of subtracted products and as a result, 600 recombinants clones were obtained. Sequence analysis of sixty nine clones, revealed redundancy of the expressed sequence tags and most of them showed no homology with reported sequences at databases and only 13 % had a high homology with metalothioneins. The results constitute a step in advance in the molecular study of Musa-Mycosphaerella fijiensis interaction.
Key words: Banana-Mycosphaerella fijiensis interaction, Black Sigatoka, Musa spp., suppression subtractive hybridization
INTRODUCCIÓN
La Sigatoka negra causada por el hongo ascomiceto Mycosphaerella fijiensis Morelet (Pseudocercospora fijiensis Morelet, anamorfo) (Crous, 2003), ha sido reconocida como la principal enfermedad foliar que afecta bananos y plátanos a nivel mundial (Marín et al., 2003).
La búsqueda de resistencia a esta enfermedad, ha sido el objetivo principal para varios grupos de investigación desde su surgimiento, pero aún no se logran avances significativos a través del mejoramiento convencional, ni mediante la utilización de técnicas biotecnológicas (Swennen et al., 2004).
Por este motivo el empleo de la biología molecular y la ingeniería genética, se presentan como herramientas útiles en los estudios relacionados con la resistencia a patógenos en plantas. Dentro de ellas la transformación genética ha sido ampliamente utilizada para estos propósitos (Pérez et al., 2006). La transformación ha sido realizada tanto por pistola de genes (Becker et al., 2000), como mediada por Agrobacterium tumefaciens (Ganapathi et al., 2001; Tripathi et al., 2005; Pérez et al., 2006); con el empleo de genes reporteros o que codifican para proteínas antifúngicas (Sreeramanan, 2006) continúa una de las estrategias a seguir, para la obtención de plantas transgénicas con resistencia a hongos.
En los últimos 5 años a partir del desarrollo de las nuevas herramientas de la genómica, las investigaciones en el género Musa, han estado encaminadas a la búsqueda de nuevas fuentes (genes) de resistencia a Mycosphaerella fijiensis Morelet. Para este propósito han sido utilizados genotipos silvestres, que presentan resistencia a la enfermedad. Una de las vías empleadas, ha sido la realización de bibliotecas de ácido desoxirribonucleico (ADN) genómicas y complementarias (ADNc). Las genómicas, mediante el empleo de diferentes vectores, para la obtención de información acerca del genoma y las complementarias, por la realización de bibliotecas sustractivas, a partir del método de Hibridación Sustractiva por Supresión (Diatchenko et al., 1996), con el fin de obtener genes expresados diferencialmente ante la infección con el patógeno. De este modo, han sido realizadas varias bibliotecas genómicas, entre ellas: en Musa acuminata subsp. burmannicoides ‘Calcutta 4’, utilizando como vector un Cromosoma Bacteriano Artificial (BAC, del inglés Bacterial Artificial Chromosome) (Vilarinhos et al., 2003), en Musa balbisiana ‘Pisang Klutuk Wulung’ (Šafá et al., 2004) y en Musa acuminata ‘Tuu’ en el vector Cromosoma Bacteriano Artificial Binario (BIBAC, del inglés Competent Binary Bacterial Artificial Chromosome) (Ortiz et al., 2005) y como resultado se cuenta con un gran número de clones con información importante para el análisis completo del genoma. Con respecto a las bibliotecas de ADNc, Dagert et al. (2002) realizaron una biblioteca sustractiva en el cultivar Yangambí km5 y como resultado encontraron la expresión de una glucanasa, como respuesta a la infección con M. fijiensis.
El método de hibridación sustractiva ha sido empleado para la obtención de genes expresados diferencialmente en plantas, ante la presencia de factores bióticos y abióticos. Por ejemplo, Xiong et al. (2001), encontraron genes en Oryza sativa que se expresaban diferencialmente ante la infección con Magnaporthe grisea y Shim et al. (2004) identificaron genes en Oryza sativa, relacionados con el estrés por la infección con Magnaporthe grisea.
En este trabajo se utiliza la técnica de hibridación sustractiva, para realizar un estudio a nivel molecular de la interacción Musa-Mycosphaerella fijiensis, mediante la construcción de una biblioteca sustractiva por supresión en el genotipo silvestre Musa acuminata subsp. burmannicoides ‘Calcutta 4’, el cual presenta resistencia a la enfermedad Sigatoka negra, con el objetivo de identificar secuencias expresadas diferencialmente, que pudieran estar relacionadas con la respuesta incompatible en estadios tempranos de la infección con Mycosphaerella fijiensis Morelet.
MATERIALES Y METODOS
Fuente del hongo y las plantas
Se utilizó el aislado CCIBP-Pf83 de Mycosphaerella fijiensis, perteneciente a la colección de cultivos microbianos del Laboratorio de Fitopatología del Instituto de Biotecnología de las Plantas (UCLV, Cuba).
Fueron utilizadas plantas de banano ‘Calcutta 4’ (AA), obtenidas del banco de germoplasma del Instituto Nacional de Viandas Tropicales (INIVIT, Santo Domingo, Cuba) y de ‘Grande naine’ (Musa AAA) del Instituto de Biotecnología de las Plantas, como control del experimento. Las mismas se propagaron in vitro según la metodología propuesta por Orellana (1994) y se aclimatizaron por ocho semanas en casas de cultivo, hasta que alcanzaron una altura de 20 cm y cuatro hojas activas.
Inoculación con Mycosphaerella fijiensis
La inoculación de las plantas de ‘Calcutta 4’ y de ‘Grande naine’, se realizó con una suspensión micelial del patógeno (CCIBP-Mf83) según el protocolo descrito por Alvarado-Capó et al. (2003).
Se tomaron muestras de plantas de ‘Calcutta 4’ inoculadas y no inoculadas (dos hojas de dos plantas) a los 6, 10 y 12 días posteriores a la inoculación (dpi). A las hojas se les eliminó la nervadura central, sumergieron en nitrógeno líquido y posteriormente se almacenaron a – 80 °C hasta su utilización.
Purificación del ácido ribonucleico total y mensajero (ARN total y ARNm)
La purificación de ARN total de las muestras de hojas se realizó de acuerdo con el protocolo descrito por Liao et al. (2004) y el ARN de micelio del hongo liofilizado según Sánchez et al. (2006). La integridad del ARN total resultante, fue analizada mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1%, en tampón TBE 1X (90 mM Tris, 90 mM H3BO3, 2 mM EDTA, pH 8.0), el cual fue teñido con Bromuro de Etidio (EtBr) 0.5 µg.ml-1. La determinación de la concentración y la pureza de las muestras se realizó por espectrofotometría (BioPhotometer Eppendorf).
Para la purificación del ARNm, se utilizaron 500 µg de cada ARN total tanto de plantas como del hongo, mediante el sistema comercial Oligotex® mRNA Mini Kit (Qiagen, GmbH). La integridad, pureza y concentración de los ARNm, se verificó de igual modo a como se refirió anteriormente. Las muestras purificadas se conservaron a – 80 °C hasta su utilización.
Hibridación sustractiva
La hibridación sustractiva se realizó con los ADNc obtenidos a partir de 2 µg de ARNm de ‘Calcutta 4’ inoculado y una mezcla sustractora de 1 µg de ARNm de la planta no inoculada y 1 µg de ARNm del hongo, según el protocolo descrito por Diatchenko et al. (1996). La concentración total de ARNm de plantas, fue una mezcla de los ARNm purificados a los 6, 10 y 12 dpi. Se siguieron las instrucciones del sistema comercial PCR-Select cDNA Subtraction (BD Biosciences Clontech), con la salvedad de que se realizaron 32 ciclos para el PCR primario y 17 ciclos para el secundario y se adicionaron 1.25 unidades de la enzima Taq ADN Polimerasa (Promega) en cada reacción. Las amplificaciones se realizaron en una máquina de PCR Mastercycler ® personal (Eppendorf).
Los productos de la sustracción se separaron en un gel de agarosa al 2 %, en tampón TAE 1X (40mM Tris, 20 mM acetato de sodio, 2mM EDTA pH 8.0), el cual fue teñido con EtBr 0.5 µg.ml-1.
Biblioteca sustractiva
La biblioteca sustractiva se confeccionó por la clonación de los productos de la sustracción, en el vector pTZ57R/TDNA, del sistema comercial InsT/ AcloneTM PCR Product Cloning y la transformación en la cepa de Escherichia coli XL1-Blue, con el sistema comercial Transform AidTM Bacterial transformation, (Fermentas). Las colonias recombinantes se seleccionaron en medio de cultivo selectivo, que contenía isopropil-ß-D-thiogalactopiranósido (IPTG) 0.1 mM, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-â-D-galactopiranósido (X Gal) 40 µg.ml-1 y como antibiótico de selección para el plasmidio, ampicillina 100 µg.ml-1. Los transformantes positivos, se analizaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polimerase chain reaction) de colonias, en un volumen final de 20 µl que contenía 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM de cada dNTP, 10 pmol de los oligonucleótidos M13 FW (5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’) y Rev (5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’), tampón PCR 1X y 1U Taq ADN polimerasa (Promega). El PCR fue iniciado por desnaturalización a 94 ºC por 10 min, seguido de 25 ciclos a 94 ºC por 1 min, 55 ºC por 1 min y 72 ºC por 30 s, con una extensión final a 72 ºC por 10 min y un paso de enfriamiento a 4 ºC.
Secuenciación de clones y comparación de secuencias en bases de datos
Se secuenciaron 69 fragmentos de genes de la biblioteca sustractiva. Las secuencias de nucleótidos fueron comparadas con la base de datos (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov), mediante el algoritmo BLAST, con la matriz BLOSUM62 (Altschul et al., 1997). Se consideraron como índice de homología significativo en la alineación de la cadena de bases nitrogenadas
(BLASTN), los valores de E menores que 0.0001 (Newman et al., 1994).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Inoculación con Mycosphaerella fijiensis
El empleo del homogenizado micelial de M. fijiensis, en las condiciones de luz y humedad existentes en la casa de cultivo, permitió un adecuado desarrollo de los síntomas de la enfermedad Sigatoka negra; lo cual se verificó visualmente en las plantas de ‘Grande naine’ empleadas como control del experimento. Este resultado concuerda con lo planteado por Alvarado-Capó et al. (2003), quienes demostraron la posibilidad de la inoculación artificial de las plantas en condiciones controladas, como un método fácil, rápido y factible para obtener el desarrollo homogéneo y uniforme de los síntomas, en hojas inoculadas de plantas procedentes del cultivo in vitro.
Purificación del ácido ribonucleico total y mensajero (ARN total y ARNm)
Los niveles de pureza de ARN total a partir de hojas sanas, hojas infectadas con Mycosphaerella fijiensis de ‘Calcutta 4’, así como del micelio del hongo, fueron superiores a 1.9, resultados que concuerdan con lo planteado por Sambrook et al. (1989). La concentración de ARN total por gramo de tejido osciló entre 2.5 y 3 µg.µl-1, además, no se observó degradación de los ácidos ribonucleicos purificados, después de verificada su integridad en un gel de agarosa. Los resultados en cuanto a la calidad y pureza de los ARN totales, indicaron la ausencia de impurezas en las purificaciones realizadas. El aislamiento de ácidos nucleicos con calidad (libre de proteínas, ADN genómico y metabolitos secundarios), es fundamental para la construcción de una biblioteca; ya que la presencia de estas sustancias contaminantes pueden afectar la calidad y rendimientos del material genético a obtener (Asif et al., 2000). Se obtuvieron purificaciones de ARNm, a partir de los ARN totales con valores de pureza superior a 2, concentración y la calidad necesaria para su empleo.
Hibridación sustractiva y biblioteca sustractiva
La comprobación realizada al producto de la hibridación sustractiva, mostró una disminución en cuanto al número de secuencias amplificadas, luego de terminado el segundo PCR, en relación con la muestra antes de la sustracción (Figura 1) y la longitud de estos fragmentos varió en un rango de 0.2 kb a 0.7 kb aproximadamente.
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Se obtuvo la biblioteca sustractiva por supresión, para Musa acuminata subsp. burmannicoides ‘Calcutta 4’, en un estadio temprano de la infección con el hongo M. fijiensis Morelet (6, 10 y 12 dpi), con un total de 600 clones recombinantes. Los resultados del análisis por PCR de colonias, mostraron que la longitud de los fragmentos osciló entre 300 y 700 pares de bases (pb) (Figura 2). La longitud de las secuencias blanco expresadas obtenidas fue la esperada ya que según Diatchenko et al. (1996), como resultado de la hibridación, se deben obtener fragmentos de aproximadamente 600 pb, lo cual está dado por la enzima de restricción que se utiliza en el protocolo. También concuerda con Xiong et al. (2001), quienes obtuvieron como resultado del análisis de una biblioteca sustractiva en arroz (Oryza sativa L.), que la longitud de algunos de los fragmentos secuenciados oscilaba entre 200 y 600 pb.
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Secuenciación de clones y comparación de secuencias en bases de datos
Aún cuando la función de las metalotioninas no está completamente dilucidada en plantas, se ha demostrado su papel en la destoxificación de metales y homeostasis tanto en organismos eucariotas como en procariotas (Ling et al., 2004). La inducción de estas proteínas como parte de la respuesta de defensa de la planta, ante la infección con el patógeno en la interacción Musa-M. fijiensis, concuerda con resultados referidos anteriormente acerca del papel de las mismas en el estrés oxidativo en plantas (Choi et al., 1996).
Del análisis por comparación de secuencias con los genes publicados en la base de datos GenBank, se evidenció que existió redundancia en los resultados para las 69 secuencias nucleotídicas en estudio. Se obtuvieron 9 (13 %) secuencias blanco expresadas (ESTs, por sus siglas del inglés Expressed Sequence Tags), con homología para metalotioninas (MTs) (proteína MWMT3 similar a una metalotionina encontrada en Musa acuminata AF268393) (Liu et al., 2002), además de ausencia de homología para la mayoría de las secuencias.
Como continuación de este trabajo, se seguirá con la caracterización de las secuencias obtenidas en la biblioteca sustractiva, mediante el uso de las herramientas bioinformáticas.
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