Vol.6, No.4, 2006.pmd
Artculo Cientfico                                                                           Biotecnologa Vegetal Vol. 6, No. 4: 213 - 217, octubre - diciembre, 2006

 

Construccin y secuenciacin parcial de una biblioteca sustractiva en Calcutta 4 (Musa AA) en estadio temprano de infeccin con Mycosphaerella fijiensis Morelet

Milady Mendoza-Rodrguez*, Aminael Snchez-Rodrguez, Mayra Acosta-Surez, Berkis Roque, Orelvis Portal, Elio Jimnez *Autor para correspondencia.

Instituto de Biotecnologa de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuan km 5.5. Santa Clara, Villa Clara, Cuba. CP 54 830. e-mail: milady@ibp.co.cu

RESUMEN

El estudio de los genes involucrados en la respuesta de defensa en la planta contra el ataque de patgenos, es uno de los pasos ms importantes para la elucidacin de los mecanismos moleculares de resistencia a enfermedades. La generacin de bibliotecas sustractivas de cido desoxirribonucleico complementario (ADNc), por medio de la tcnica de hibridacin sustractiva por supresin, ha sido utilizada para este propsito. En este trabajo se realiz una hibridacin sustractiva, entre el ADNc obtenido de hojas de Calcutta 4 inoculadas con M. fijiensis (CCIBP-Pf83) y una mezcla de ADNc de hojas de Calcutta 4 no inoculadas y del micelio del hongo. Las muestras de hojas se tomaron a los 6, 10 y 12 das posteriores a la inoculacin. La biblioteca sustractiva se obtuvo por clonacin y transformacin de los productos sustrados y como resultado se obtuvieron 600 clones recombinantes. El anlisis de secuencia de 69 clones revel redundancia de las secuencias blanco expresadas, la mayora no mostr homologa con secuencias en las bases de datos. El 13 % tuvo alta homologa con metalotioninas. Los resultados constituyen un paso de avance en el estudio a nivel molecular de la interaccin Musa- Mycosphaerella fijiensis.

Palabras clave: hibridacin sustractiva por supresin, interaccin Banano-Mycosphaerella fijiensis, Musa spp., Sigatoka negra

ABSTRACT

The study of genes involved in plant defense response against pathogen attack, is one of most important steps leading to the elucidation of disease resistance molecular mechanisms. The generation of subtracted deoxyribonucleic acid libraries (cDNA), by means of suppression subtractive hybridization technique (SSH), has been used for this purpose. A subtractive hybridization was made between a cDNA population obtained from Calcutta 4 inoculated leaves with M. fijiensis (CCIBP-Pf83) and a mixture of cDNA from Calcutta 4 non inoculated leaves and mycelium. Leaves samples were taken at 6, 10 and 12 days after inoculation. The subtracted library was obtained by cloning and transformation of subtracted products and as a result, 600 recombinants clones were obtained. Sequence analysis of sixty nine clones, revealed redundancy of the expressed sequence tags and most of them showed no homology with reported sequences at databases and only 13 % had a high homology with metalothioneins. The results constitute a step in advance in the molecular study of Musa-Mycosphaerella fijiensis interaction.

Key words: Banana-Mycosphaerella fijiensis interaction, Black Sigatoka, Musa spp., suppression subtractive hybridization

INTRODUCCIN

La Sigatoka negra causada por el hongo ascomiceto Mycosphaerella fijiensis Morelet (Pseudocercospora fijiensis Morelet, anamorfo) (Crous, 2003), ha sido reconocida como la principal enfermedad foliar que afecta bananos y pltanos a nivel mundial (Marn et al., 2003).

La bsqueda de resistencia a esta enfermedad, ha sido el objetivo principal para varios grupos de investigacin desde su surgimiento, pero an no se logran avances significativos a travs del mejoramiento convencional, ni mediante la utilizacin de tcnicas biotecnolgicas (Swennen et al., 2004).

Por este motivo el empleo de la biologa molecular y la ingeniera gentica, se presentan como herramientas tiles en los estudios relacionados con la resistencia a patgenos en plantas. Dentro de ellas la transformacin gentica ha sido ampliamente utilizada para estos propsitos (Prez et al., 2006). La transformacin ha sido realizada tanto por pistola de genes (Becker et al., 2000), como mediada por Agrobacterium tumefaciens (Ganapathi et al., 2001; Tripathi et al., 2005; Prez et al., 2006); con el empleo de genes reporteros o que codifican para protenas antifngicas (Sreeramanan, 2006) contina una de las estrategias a seguir, para la obtencin de plantas transgnicas con resistencia a hongos.

En los ltimos 5 aos a partir del desarrollo de las nuevas herramientas de la genmica, las investigaciones en el gnero Musa, han estado encaminadas a la bsqueda de nuevas fuentes (genes) de resistencia a Mycosphaerella fijiensis Morelet. Para este propsito han sido utilizados genotipos silvestres, que presentan resistencia a la enfermedad. Una de las vas empleadas, ha sido la realizacin de bibliotecas de cido desoxirribonucleico (ADN) genmicas y complementarias (ADNc). Las genmicas, mediante el empleo de diferentes vectores, para la obtencin de informacin acerca del genoma y las complementarias, por la realizacin de bibliotecas sustractivas, a partir del mtodo de Hibridacin Sustractiva por Supresin (Diatchenko et al., 1996), con el fin de obtener genes expresados diferencialmente ante la infeccin con el patgeno. De este modo, han sido realizadas varias bibliotecas genmicas, entre ellas: en Musa acuminata subsp. burmannicoides Calcutta 4, utilizando como vector un Cromosoma Bacteriano Artificial (BAC, del ingls Bacterial Artificial Chromosome) (Vilarinhos et al., 2003), en Musa balbisiana Pisang Klutuk Wulung (af et al., 2004) y en Musa acuminata Tuu en el vector Cromosoma Bacteriano Artificial Binario (BIBAC, del ingls Competent Binary Bacterial Artificial Chromosome) (Ortiz et al., 2005) y como resultado se cuenta con un gran nmero de clones con informacin importante para el anlisis completo del genoma. Con respecto a las bibliotecas de ADNc, Dagert et al. (2002) realizaron una biblioteca sustractiva en el cultivar Yangamb km5 y como resultado encontraron la expresin de una glucanasa, como respuesta a la infeccin con M. fijiensis.

El mtodo de hibridacin sustractiva ha sido empleado para la obtencin de genes expresados diferencialmente en plantas, ante la presencia de factores biticos y abiticos. Por ejemplo, Xiong et al. (2001), encontraron genes en Oryza sativa que se expresaban diferencialmente ante la infeccin con Magnaporthe grisea y Shim et al. (2004) identificaron genes en Oryza sativa, relacionados con el estrs por la infeccin con Magnaporthe grisea.

En este trabajo se utiliza la tcnica de hibridacin sustractiva, para realizar un estudio a nivel molecular de la interaccin Musa-Mycosphaerella fijiensis, mediante la construccin de una biblioteca sustractiva por supresin en el genotipo silvestre Musa acuminata subsp. burmannicoides Calcutta 4, el cual presenta resistencia a la enfermedad Sigatoka negra, con el objetivo de identificar secuencias expresadas diferencialmente, que pudieran estar relacionadas con la respuesta incompatible en estadios tempranos de la infeccin con Mycosphaerella fijiensis Morelet.

MATERIALES Y METODOS

Fuente del hongo y las plantas

Se utiliz el aislado CCIBP-Pf83 de Mycosphaerella fijiensis, perteneciente a la coleccin de cultivos microbianos del Laboratorio de Fitopatologa del Instituto de Biotecnologa de las Plantas (UCLV, Cuba).

Fueron utilizadas plantas de banano Calcutta 4 (AA), obtenidas del banco de germoplasma del Instituto Nacional de Viandas Tropicales (INIVIT, Santo Domingo, Cuba) y de Grande naine (Musa AAA) del Instituto de Biotecnologa de las Plantas, como control del experimento. Las mismas se propagaron in vitro segn la metodologa propuesta por Orellana (1994) y se aclimatizaron por ocho semanas en casas de cultivo, hasta que alcanzaron una altura de 20 cm y cuatro hojas activas.

Inoculacin con Mycosphaerella fijiensis

La inoculacin de las plantas de Calcutta 4 y de Grande naine, se realiz con una suspensin micelial del patgeno (CCIBP-Mf83) segn el protocolo descrito por Alvarado-Cap et al. (2003).

Se tomaron muestras de plantas de Calcutta 4 inoculadas y no inoculadas (dos hojas de dos plantas) a los 6, 10 y 12 das posteriores a la inoculacin (dpi). A las hojas se les elimin la nervadura central, sumergieron en nitrgeno lquido y posteriormente se almacenaron a 80 °C hasta su utilizacin.

Purificacin del cido ribonucleico total y mensajero (ARN total y ARNm)

La purificacin de ARN total de las muestras de hojas se realiz de acuerdo con el protocolo descrito por Liao et al. (2004) y el ARN de micelio del hongo liofilizado segn Snchez et al. (2006). La integridad del ARN total resultante, fue analizada mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1%, en tampn TBE 1X (90 mM Tris, 90 mM H3BO3, 2 mM EDTA, pH 8.0), el cual fue teido con Bromuro de Etidio (EtBr) 0.5 g.ml-1. La determinacin de la concentracin y la pureza de las muestras se realiz por espectrofotometra (BioPhotometer Eppendorf).

Para la purificacin del ARNm, se utilizaron 500 g de cada ARN total tanto de plantas como del hongo, mediante el sistema comercial Oligotex® mRNA Mini Kit (Qiagen, GmbH). La integridad, pureza y concentracin de los ARNm, se verific de igual modo a como se refiri anteriormente. Las muestras purificadas se conservaron a 80 °C hasta su utilizacin.

Hibridacin sustractiva

La hibridacin sustractiva se realiz con los ADNc obtenidos a partir de 2 g de ARNm de Calcutta 4 inoculado y una mezcla sustractora de 1 g de ARNm de la planta no inoculada y 1 g de ARNm del hongo, segn el protocolo descrito por Diatchenko et al. (1996). La concentracin total de ARNm de plantas, fue una mezcla de los ARNm purificados a los 6, 10 y 12 dpi. Se siguieron las instrucciones del sistema comercial PCR-Select cDNA Subtraction (BD Biosciences Clontech), con la salvedad de que se realizaron 32 ciclos para el PCR primario y 17 ciclos para el secundario y se adicionaron 1.25 unidades de la enzima Taq ADN Polimerasa (Promega) en cada reaccin. Las amplificaciones se realizaron en una mquina de PCR Mastercycler ® personal (Eppendorf).

Los productos de la sustraccin se separaron en un gel de agarosa al 2 %, en tampn TAE 1X (40mM Tris, 20 mM acetato de sodio, 2mM EDTA pH 8.0), el cual fue teido con EtBr 0.5 g.ml-1.

Biblioteca sustractiva

La biblioteca sustractiva se confeccion por la clonacin de los productos de la sustraccin, en el vector pTZ57R/TDNA, del sistema comercial InsT/ AcloneTM PCR Product Cloning y la transformacin en la cepa de Escherichia coli XL1-Blue, con el sistema comercial Transform AidTM Bacterial transformation, (Fermentas). Las colonias recombinantes se seleccionaron en medio de cultivo selectivo, que contena isopropil--D-thiogalactopiransido (IPTG) 0.1 mM, 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiransido (X Gal) 40 g.ml-1 y como antibitico de seleccin para el plasmidio, ampicillina 100 g.ml-1. Los transformantes positivos, se analizaron mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, del ingls polimerase chain reaction) de colonias, en un volumen final de 20 l que contena 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM de cada dNTP, 10 pmol de los oligonucletidos M13 FW (5-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3) y Rev (5-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3), tampn PCR 1X y 1U Taq ADN polimerasa (Promega). El PCR fue iniciado por desnaturalizacin a 94 C por 10 min, seguido de 25 ciclos a 94 C por 1 min, 55 C por 1 min y 72 C por 30 s, con una extensin final a 72 C por 10 min y un paso de enfriamiento a 4 C.

Secuenciacin de clones y comparacin de secuencias en bases de datos

Se secuenciaron 69 fragmentos de genes de la biblioteca sustractiva. Las secuencias de nucletidos fueron comparadas con la base de datos (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov), mediante el algoritmo BLAST, con la matriz BLOSUM62 (Altschul et al., 1997). Se consideraron como ndice de homologa significativo en la alineacin de la cadena de bases nitrogenadas

(BLASTN), los valores de E menores que 0.0001 (Newman et al., 1994).

RESULTADOS Y DISCUSIN

Inoculacin con Mycosphaerella fijiensis

El empleo del homogenizado micelial de M. fijiensis, en las condiciones de luz y humedad existentes en la casa de cultivo, permiti un adecuado desarrollo de los sntomas de la enfermedad Sigatoka negra; lo cual se verific visualmente en las plantas de Grande naine empleadas como control del experimento. Este resultado concuerda con lo planteado por Alvarado-Cap et al. (2003), quienes demostraron la posibilidad de la inoculacin artificial de las plantas en condiciones controladas, como un mtodo fcil, rpido y factible para obtener el desarrollo homogneo y uniforme de los sntomas, en hojas inoculadas de plantas procedentes del cultivo in vitro.

Purificacin del cido ribonucleico total y mensajero (ARN total y ARNm)

Los niveles de pureza de ARN total a partir de hojas sanas, hojas infectadas con Mycosphaerella fijiensis de Calcutta 4, as como del micelio del hongo, fueron superiores a 1.9, resultados que concuerdan con lo planteado por Sambrook et al. (1989). La concentracin de ARN total por gramo de tejido oscil entre 2.5 y 3 g.l-1, adems, no se observ degradacin de los cidos ribonucleicos purificados, despus de verificada su integridad en un gel de agarosa. Los resultados en cuanto a la calidad y pureza de los ARN totales, indicaron la ausencia de impurezas en las purificaciones realizadas. El aislamiento de cidos nucleicos con calidad (libre de protenas, ADN genmico y metabolitos secundarios), es fundamental para la construccin de una biblioteca; ya que la presencia de estas sustancias contaminantes pueden afectar la calidad y rendimientos del material gentico a obtener (Asif et al., 2000). Se obtuvieron purificaciones de ARNm, a partir de los ARN totales con valores de pureza superior a 2, concentracin y la calidad necesaria para su empleo.

Hibridacin sustractiva y biblioteca sustractiva

La comprobacin realizada al producto de la hibridacin sustractiva, mostr una disminucin en cuanto al nmero de secuencias amplificadas, luego de terminado el segundo PCR, en relacin con la muestra antes de la sustraccin (Figura 1) y la longitud de estos fragmentos vari en un rango de 0.2 kb a 0.7 kb aproximadamente.

Se obtuvo la biblioteca sustractiva por supresin, para Musa acuminata subsp. burmannicoides Calcutta 4, en un estadio temprano de la infeccin con el hongo M. fijiensis Morelet (6, 10 y 12 dpi), con un total de 600 clones recombinantes. Los resultados del anlisis por PCR de colonias, mostraron que la longitud de los fragmentos oscil entre 300 y 700 pares de bases (pb) (Figura 2). La longitud de las secuencias blanco expresadas obtenidas fue la esperada ya que segn Diatchenko et al. (1996), como resultado de la hibridacin, se deben obtener fragmentos de aproximadamente 600 pb, lo cual est dado por la enzima de restriccin que se utiliza en el protocolo. Tambin concuerda con Xiong et al. (2001), quienes obtuvieron como resultado del anlisis de una biblioteca sustractiva en arroz (Oryza sativa L.), que la longitud de algunos de los fragmentos secuenciados oscilaba entre 200 y 600 pb.

Secuenciacin de clones y comparacin de secuencias en bases de datos

An cuando la funcin de las metalotioninas no est completamente dilucidada en plantas, se ha demostrado su papel en la destoxificacin de metales y homeostasis tanto en organismos eucariotas como en procariotas (Ling et al., 2004). La induccin de estas protenas como parte de la respuesta de defensa de la planta, ante la infeccin con el patgeno en la interaccin Musa-M. fijiensis, concuerda con resultados referidos anteriormente acerca del papel de las mismas en el estrs oxidativo en plantas (Choi et al., 1996).

Del anlisis por comparacin de secuencias con los genes publicados en la base de datos GenBank, se evidenci que existi redundancia en los resultados para las 69 secuencias nucleotdicas en estudio. Se obtuvieron 9 (13 %) secuencias blanco expresadas (ESTs, por sus siglas del inglés Expressed Sequence Tags), con homología para metalotioninas (MTs) (proteína MWMT3 similar a una metalotionina encontrada en Musa acuminata AF268393) (Liu et al., 2002), además de ausencia de homología para la mayoría de las secuencias.

Como continuacin de este trabajo, se seguir con la caracterizacin de las secuencias obtenidas en la biblioteca sustractiva, mediante el uso de las herramientas bioinformticas.

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