Vol.5, No.1, 2005 
Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 5, No. 1: 27 - 32 enero - marzo, 2005

 

 

Metodología para el diagnóstico molecular del Virus del Mosaico de la Malanga para la certificación de plantas in vitro de clones comerciales de malanga

José E. González Rámirez1*; Ricardo Hernández Peréz2; Orelvis Portal Villafaña3; Adela Pairol Martínez1 y Yilian González Moya1. *Autor para correspondencia.

1 Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT). Apartado 6, Santo Domingo, Villa Clara. josee@inivit.co.cu

2 Centro de Estudios para la Transformación Agraria Sostenible (CETAS). Carretera a Rodas, Km 12, Cienfuegos. ricardoh@fca.ucf.edu.cu

3 Instituto de Biotecnología de las Plantas. Carretera a Camajuaní Km 5 ½. Santa Clara, Villa Clara. oportal@ibp.co.cu

RESUMEN

La propagación acelerada de clones de malanga (Xanthosoma spp.) y (Colocasia esculenta L.) a través de técnicas biotecnológicas ha generado una gran demanda de líneas saneadas especialmente al Virus del Mosaico de la Malanga. Este patógeno perteneciente al grupo de los potivirus constituye el agente causal de la enfermedad viral más importante del cultivo que causa pérdidas de hasta un 40% en clones comerciales. El diagnóstico inmunoquímico utilizado en los programas de certificación masiva, con grandes ventajas sobre otros tipos de análisis, tiene un límite de sensibilidad que puede permitir escape de material vegetal contaminado. Con la introducción de técnicas moleculares de diagnóstico se pueden detectar pequeñas concentraciones virales en plantas in vitro. En el presente trabajo se realiza la detección del Virus del Mosaico de la Malanga mediante la utilización de la técnica de reverso transcripción seguida por la reacción en cadena de la polimerasa. Se validó la metodología establecida y se certificaron líneas plantas in vitro de malanga que serán usadas en procesos de micropropagación en biofábricas.

Palabras clave: Colocasia, DMV, plantas sanas, RT-PCR, Xanthosoma

ABSTRACT

The quick propagation of Dasheen clones (Xanthosoma spp) and (Colocasia esculenta L.) through biotechnical techniques has generated a great demand of free of diseases lines, especially to the Dasheen Mosaic Virus, this pathogen, belonging to the potivirus group, is the most important viral disease that affect the crop leading up to 40% of yield losses. The UM-ELISA diagnostic useded in massive certification programs, with big advantages over other kinds of analysis, has a limit of sensibility that can allow escape of contaminated vegetal material. With the introduction of molecular techniques of diagnostic small viral concentrations can be detected in vitroplants. In the present work, the detection of the Dasheen Mosaic Virus using the technique of reverse transcription and polymerase chain reaction is carried out. The established methodology was validated and lines of in vitro plants of dasheen were certified to be used in the micropropagation in biofactories.

Xanthosoma

Key words: Colocasia, DMV, healthy plants, RT-PCR,

INTRODUCCIÓN

Entre los problemas fitosanitarios más importantes de la malanga están las enfermedades virales. En los últimos años el Virus del Mosaico de la Malanga (DMV, por sus siglas en inglés) se ha extendido ampliamente por todas las zonas donde se cultiva la malanga en Cuba (Quintero, comunicación personal) La introducción masiva en las biofábricas de grandes volúmenes de plantas in vitro por parte del Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT) requiere la certificación fitosanitaria del mismo para evitar la diseminación del virus en el material vegetal. Este proceso se realiza siguiendo la técnica conocida como Ultra-Micro-Enzime Linked Inmuno Sorbent Assay Double Antibody Sandwich (UM-ELISA DAS), utilizando un antisuero policlonal producido en el INIVIT con un límite de sensibilidad de 150 μg.ml-1 de proteína viral (Hernández et al., 2000). Muchas veces la concentración viral en el tejido vegetal no es lo suficiente alta o incluso, la enfermedad puede permanecer estado de latencia, por lo cual el diagnóstico inmunoquímico resulta incapaz de detectar la presencia viral en dichos casos (Jones et al., 2001 y Hernández et al., 2002). Esta metodología masiva de certificación presenta el riesgo de escape de material vegetal falso negativo dentro del proceso de micropropagación.

El DMV pertenece al grupo de los potivirus. Los viriones son flexuosos y en forma de varilla, cuya extensión es de 680-900 nm y un ancho de 11-15 nm. El extremo 3' del genoma contiene una región poliadenilada de longitud variable (Hari et al., 1979). Las secuencias de nucleótidos que aparecen en el extremo 3’ del gen que codifica para la CP han sido usadas ampliamente para identificar y diferenciar distintos potivirus (Shukla y Ward, 1989; Aleman-Verdaguer et al., 1997; Bousalem et al., 2000; Jacob y Usha, 200; Oruetxebarria y Valkonen, 2001) por encontrarse en este sitio la región mas conservada del genoma de los potivirus.

Las técnicas de biología molecular aplicadas en el diagnóstico de fitopatógenos, aunque de reciente introducción, son herramientas de inigualable valor para la detección de los mismos en concentraciones mínimas (fg.ml-1), dentro del tejido vegetal. El presente trabajo tuvo como finalidad confirmar la presencia de este virus, mediante la amplificación de un fragmento comprendido entre una región conservada del gen de la proteína de la cápsida (CP) y la región no traducible (UTR, por sus siglas en inglés) para posteriormente establecer un protocolo de certificación combinando las técnicas de UM-ELISA DAS (en las valuaciones iniciales) y la técnica de RT-PCR para la validación de los resultados.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal de partida

Se utilizaron plantas in vitro de (Xanthosoma spp. y Colocasia esculenta L.), previamente analizadas por la técnica de UM-ELISA DAS con antisuero policlonal comercializado por Agdia, como controles sanos y enfermos de la enfermedad, las cuales fueron mantenidas en macetas en el aislador de patógenos, donde desarrollaron síntomas típicos del DMV.

Oligonucleótidos utilizados en las reacciones de reverso transcripción (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés)

Se utilizó una pareja de oligonucleótidos denominada CN 48 “Forward” y una mezcla de oligonucleótidos dT (CN 47, CN 54 y CN 55) “Reverse”, para la amplificación de una región que comprende el extremo 3´ terminal del gen de la CP del DMV y la región no traducible (Figura 1) (Pappu et al., 1993).

Purificación del ácido ribonucleico (ARN) total

Se utilizaron dos métodos de purificación de ARN a partir de tejido foliar de malanga (Xanthosoma spp. y Colocasia esculenta L.) que se describen a continuación. A partir de las lecturas en espectrofotómetro del ARN total, obtenido de tres plantas in vitro enfermas con DMV, purificado por ambos métodos, se estableció una comparación en cuanto a la concentración y pureza (relación de los valores de absorvancia leídos a 260 y 280 nm) de los mismos, para poder establecer la aplicabilidad de cada uno al protocolo de RT-PCR y su inclusión dentro de un protocolo de certificación masivo de plantas in vitro de malanga (Figura 1)

Purificación con TRIzol

Para la purificación de ARN total se utilizó 1 g de tejido foliar (plantas in vitro sanas y enfermas) y se siguió el protocolo descrito por el fabricante para la utilización del TRIzol (GIBCO, BRL).

Purificación con Cloruro de litio

Se partió de 0.4 g de tejido foliar para la purificación del ARN total mediante el siguiente protocolo: macerar el tejido en nitrógeno líquido; añadir tampón de homogenización 2 ml.g-1 de tejido (100 mM Tris-HCl pH 9, 200 mM de cloruro de sodio, 15 mM EDTA, 0.5 % de sarcosyl y 100 mM de â-mercaptoetanol), añadir 2 ml fenol:cloroformo:isoamilalcohol (25:24:1), dar vortex a alta velocidad 1-2 min, añadir 3M acetato de sodio pH 5.2 (0.14 ml.g-1), dar vortex 30 s, mantener 15 min en hielo, centrifugar a 16 000 rpm por 10 min a 4 ºC; pasar la fase acuosa a otro tubo y añadir isopropanol frío; dejar 20 min a -70 ºC, centrifugar a 10 000 rpm por 10 min a 4 ºC; lavar el precipitado con etanol absoluto y volver a centrifugar a 10 000 rpm por 10 min a 4 ºC; poner a secar el precipitado y resuspender en 900 ìl de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) a temperatura ambiente; centrifugar a 10 000 rpm por 5 min a 4 ºC, pasar el sobrenadante a un tubo nuevo, ajustar el volumen a 900 ìl; añadir 300 ìl de 8 M cloruro de litio (para una concentración final de 2M) y colocar en hielo por 3 h; centrifugar a 14 000 rpm por 10 min; lavar el precipitado en etanol absoluto, centrifugar a 10 000 rpm por 5 min a 4 ºC, secar el precipitado y resuspender en 100 ìl de agua libre de RNAsa a temperatura ambiente.

Reverso transcripción y amplificación de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc)

Para la reacción de reverso transcripción se utilizó una mezcla de 2 ì l d e tampón 10X, 4 ì l d e MgCl2 25 mM, 2 ìl de una mezcla de dNTP 10 mM, 1.7 ìl de una mezcla de oligonucleotidos dT (CN 47, CN 54, CN 55), 1 ìl de inhibidor de ribonucleasas, 1 ìl de Reverso Transcriptasa AMV (SIGMA) y 8 ìl del ARN (250 ng.ì l-1). La mezcla fue incubada durante 10 min a 25 °C y luego 60 min a 37 °C, Posteriormente se incubó a 99 °C durante 15 min y 5 min a 4 °C.

Del ADN complementario (ADNc) obtenido se tomaron 2 ìl y se adicionaron a la mezcla de PCR para su amplificación, compuesta por 2 ìl de tampón 10X, 4 ì l d e una mezcla de dNTP 10 mM, 1 ìl de enzima Ta q ADN Polimerasa (Promega), 9.7 ìl de H2O, 1.7 ìl del oligonucleótido CN 48 y 1.6 ìl de una mezcla de oligonucleótidos dT (CN 47, CN 54 y CN 55). La reacción de PCR se realizó bajo las siguientes condiciones 1 min a 93 °C, 1 min a 50 °C y 1 a min 72 °C durante 30 ciclos.

Los fragmentos amplificados fueron observados en un gel de agarosa de 0.8 % en tampón TBE 1X (890 mM Tris-borato, 890 mM ácido bórico y 20 mM EDTA), teñido con bromuro de etidio (0.5 ìg.ml-1) y visualizado en un transiluminador ultra violeta (UV).

Validación del ensayo molecular

La validación de las condiciones del análisis molecular se realizó con la aplicación de la metodología propuesta por Peralta y Villoch (1999). Se seleccionaron un grupo de 60 muestras (20 positivas y 40 negativas), previamente analizadas por UM-ELISA DAS con antisuero específico para DMV procedente de AGDIA Co., y establecidas como controles de referencia. Además se evaluó la especificidad analítica contra el PRSV perteneciente a la familia de los potivirus.

Obtención y certificación de plantas sanas destinadas al banco de germoplasma y biofábricas

Se utilizaron 100 explantes (tomado cada uno como una línea) tomados del programa de saneamiento del INIVIT (Hernández et al., 2000) con diagnóstico negativo por UM-ELISA DAS con antisuero policlonal AGDIA. Luego se multiplicaron las líneas establecidas in vitro, según tecnología para la micropropagación de la malanga (García et al., 1999). Finalmente después del segundo subcultivo se realizó un segundo análisis serológico y se volvió a verificar el 10 % de las muestras mediante el análisis molecular por RT-PCR. Finalmente se propone un esquema de certificación de plantas in vitro de malanga.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Purificación del ARN total

El método de purificación empleando TRIzol permitió la purificación de ARN total de manera muy rápida. Ello disminuye considerablemente el riesgo de degradación del mismo y permite (junto a la calidad del ARN obtenido su utilización en el protocolo masivo de diagnóstico. Con el método de purificación con Cloruro de litio se obtuvo una mayor concentración de ARN total y un mayor grado de pureza, aunque esta última sin diferencia estadística encontrada, (Tabla 1), lo que resulta muy importante cuando se disponen de pequeñas cantidades de muestras in vitro.

Reverso transcripción y amplificación del ADNc

El resultado de la RT-PCR permitió visualizar una banda electroforética de aproximadamente 0.5 kb en el ARN purificado a partir controles enfermos, mientras que cuando se utilizó el ARN de controles sanos, mantenidos ambos en el aislador de patógenos, no se apreció amplificación de banda alguna (Figura 2).

La amplificación dada por el uso de los oligonucleótidos utilizados demuestra, la posibilidad de utilizar este procedimiento con fines de diagnóstico. Lo anterior coincide con lo planteado por Pappu et al. (1993, 1994) que utilizaron el oligonucleótidos CN 48 para amplificar la porción final del gen que codifica para la proteína de la cápsida del DMV, el mismo está basado en la región conservada WCIEN de la proteína de cápsida de los potivirus.

Validación del ensayo molecular

Los resultados obtenidos, al evaluar por RT-PCR, los 20 controles positivos y 40 negativos (según UM-ELISA DAS) permitieron detectar los falsos positivos y falsos negativos (Tabla 2), los que sirvieron de base para la realización de los cálculos de los parámetros de validación.

Atendiendo a los indicadores de validación determinados para el análisis por RT-PCR se pudieron calcular los índices de sensibilidad diagnóstica (D-SN), sensibilidad analítica (A-SN), especificidad diagnóstica (D-SP), eficacia (E), valor predictivo de positividad (VPP), valor predictivo de negatividad (VPN), repetibilidad y la especificidad analítica contra el PRSV (Tabla 3).

Obtención y certificación de plantas sanas destinadas al banco de germoplasma y biofábricas

Durante la segunda verificación del 10 % de las plantas sanas en los análisis por serología, se pudo detectar muestras enfermas (líneas 7 y 9 diagnosticadas sanas por UM-ELISA DAS después del 2do subcultivo), dado el nivel más alto de sensibilidad del diagnóstico molecular (RT-PCR) utilizado en este caso (Figura 3). Ello permitió corroborar la importancia del diagnóstico molecular para validar la utilización del esquema de saneamiento propuesto para este virus. Se propone entonces la realización de un análisis de verificación al 10 % de las líneas de plantas in vitro que han sido diagnosticadas sanas por UM-ELISA DAS después del 4to-5to subcultivo.

Aplicación masiva de la metodología en el Laboratorio de Biotecnología del INIVIT

La certificación de plantas in vitro primeramente por UM-ELISA DAS (dos veces, al iniciar los explantes y después del 2do subcultivo) y luego en la verificación por RT-PCR (después del 4to-5to subcultivo) permitió la utilización de las líneas sanas en la propagación masiva de plantas in vitro para el banco de germoplasma presente en el INIVIT y las biofábricas.

Esta metodología de diagnóstico aplicada al programa de saneamiento del INIVIT (Hernández et al., 2000), permitió la liberación de material vegetal libre de DMV a las biofábricas.

La confirmación por RT-PCR, de la negatividad de las líneas, provenientes del programa de saneamiento del INIVIT (Hernández et al., 2000) (Figura 4), brinda la posibilidad de utilizar el esquema de saneamiento propuesto para la erradicación del DMV en malanga (Figura 5), para muestras positivas que antes se eliminaban del proceso. Basados en el menor límite de sensibilidad del RT-PCR con respecto al UM-ELISA.

CONCLUSIONES

El diagnóstico molecular por RT-PCR del Virus del Mosaico de la Malanga, utilizado en la recomprobación de la negatividad al DMV de las plantas in vitro, permitió detectar en un 5 % de muestras enfermas dentro de las líneas que habían sido diagnosticadas sanas por UM-ELISA DAS (por dos veces) lo cual corrobora la necesidad de su utilización (a pesar del encarecimiento de los costos de producción) para evitar la micropropagación y distribución de material vegetal enfermo.

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