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Artículo original
Biotecnología Vegetal Vol. 18, No. 1: 37 - 45, enero - marzo, 2018
Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.
eISSN 2074-8647, RNPS: 2154
Composición fitoquímica y actividad antibacteriana de extractos de hoja de Hamelia patens Jacq.
Phytochemical and antibacterial properties of leaf extract of Hamelia patens Jacq.
Yasmary Rubio Fontanills, Aymara L Valdivia Ávila, Conrado Camacho Campos, Madyu Matos Trujillo, Maryla Sosa del Castillo, Yunel Pérez Hernández
Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Matanzas. Autopista a Varadero km 3/2. Matanzas. Matanzas. Cuba. CP 44740. e-mail: yunel.perez@umcc.cu
RESUMEN
El ponasí (Hamelia patens Jacq.) es un arbusto distribuido ampliamente en las regiones tropicales y de uso en la medicina tradicional para el tratamiento de heridas y procesos inflamatorios. El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la composición fitoquímica y la actividad antibacteriana de extractos de hojas de ponasí presentes en áreas cercanas al Jardín Botánico de Matanzas, en la provincia de Matanzas, Cuba. Se colectaron hojas sanas en las cuales se determinaron las cantidades relativas de metabolitos secundarios y se cuantificó el contenido de fenoles solubles, ligados a pared celular y totales, así como de azúcares reductores. Se evaluó la actividad antimicrobiana del extracto etanólico frente a Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Escherichia coli. Se observó la presencia de terpenos, flavonoides, cumarinas, taninos, esteroides y glucósidos cardiotónicos en extractos metanólicos y etanólicos, que en el solvente etanólico estuvieron representados en mayores proporciones. El extracto etanólico de hoja tuvo un efecto antibacteriano frente a S. aureus y S. epidermidis, mientras que no mostró actividad inhibitoria frente a E. coli. El estudio fitoquímico y microbiológico realizado evidencia las potencialidades de Hamelia patens Jacq. como fuente de compuestos bioactivos con diferentes actividades biológicas y justifica el uso etnobotánico de esta especie en el tratamiento de infecciones bacterianas.
Palabras clave: fenoles, metabolitos secundarios, ponasí, Staphylococcus aureus
ABSTRACT
The firebush (Hamelia patens Jacq.) is a bush widely distributed in tropical areas and used in the traditional medicine for the treatments of wound and inflammatory process. The aim of the present work was to determine the phytochemical composition and the antibacterial activity of leaf extracts of firebush grown closely to the Botanical Garden of Matanzas, in the province of Matanzas, Cuba. Disease free leaves were collected, the qualitative amounts of several secondary metabolites were determined and it was quantified the content of soluble, wall-linked and total phenols as well as reducing sugars. The antibacterial activity of the ethanolic extract against Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli was evaluated. Terpenoids, flavonoids, coumarins, tannins, steroids and cardiotonic glycosides were observed in methanolic and ethanolic extracts, although, the metabolites were detected in higher proportions when using the etanolic solvent. The leaf ethanolic extract exhibited an antibacterial effect against Staphylococcus aureus and S. epidermidis, however non-inhibitory effect was shown against Escherichia coli. The phytochemistry and the antibacterial evaluation carried out point out the potentialities of Hamelia patens Jacq. as a source of bioactive compounds, with different biological activities and supports the ethno-botanical use of this plant for the treatment of bacterial infections.
Keywords: firebush, phenols, secondary metabolites, Staphylococcus aureus
INTRODUCCIÓN
Las plantas medicinales se han utilizado durante siglos para el tratamiento de numerosas enfermedades y contienen compuestos bioactivos con efectos curativos potenciales. Los estudios fitoquímicos y biológicos de las plantas medicinales, basados en la información etnobotánica, han permitido el desarrollo de fármacos útiles. Sin embargo, las investigaciones que validan el uso empírico de muchas plantas medicinales todavía son escasas (Jiménez-Suárez et al., 2016).
Hamelia patens Jacq. (Rubiaceae) es un arbusto ornamental nativo de áreas tropicales, el cual se emplea tradicionalmente en el tratamiento de procesos inflamatorios, dermatológicos, picaduras de insectos, disentería, asma y diabetes (Ahmad et al., 2012; Surana y Wagh, 2015). En trabajos relacionados con la evaluación biológica de extractos de H. patens, se observaron diferentes efectos como cicatrizante (Gomez-Beloz et al., 2003), antimicrobiano (Vijayvergia et al., 2012), diurético (Ahmad, 2012), antiinflamatorio (Surana y Wagh, 2015) y antioxidante (Surana et al., 2016).
En estudios fitoquímicos previos con esta planta se identificaron diferentes metabolitos secundarios como esteroides, saponinas, alcaloides, flavonoides y polifenoles (Jiménez-Suárez et al., 2012; Surana et al., 2016). Sin embargo, el perfil fitoquímico de las plantas depende de numerosos factores como el genotipo, la edad fisiológica de la planta, el tipo de órgano, las condiciones edafoclimáticas (en interacción con el genotipo), el momento del corte y el procesamiento de la muestra (Quiñones et al., 2012; Rodríguez-García et al., 2015; Cervantes et al., 2017). Por estas razones, es importante el estudio fitoquímico y el análisis de las propiedades biológicas de plantas presentes en los territorios, que permitan justificar sus usos etnobotánicos.
El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la composición fitoquímica y la actividad antibacteriana de extractos de hojas de Hamelia patens Jacq.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se utilizaron plantas de Hamelia patens Jacq. presentes en áreas colindantes al Jardín Botánico de Matanzas, en la ciudad de Matanzas, Cuba. La identificación taxonómica de la especie la realizaron especialistas del Jardín Botánico de Matanzas, a partir del análisis de los caracteres morfológicos in situ y la comparación con muestras presentes en el herbario de dicha entidad. La colecta se realizó en abril de 2016 y se seleccionaron ramas de plantas adultas que no presentaban síntomas de enfermedades o ataque de plagas.
Preparación de los extractos
Las hojas colectadas se lavaron con agua destilada para eliminar el polvo y posteriormente se procedió al secado en una estufa (Boxun) a 45 °C. Las hojas secas se trituraron en un molino eléctrico hasta obtener un polvo con partículas inferiores a 0.2 mm (Niranjan et al., 2013).
Se realizaron extractos etanólicos y metanólicos. Para ello se mezclaron 5 g de polvo de las hojas secas con 50 ml de etanol 90% (v/v) o metanol 90% (v/v), en Erlenmeyers de 250 ml con tapones de algodón, y se colocaron en agitación sobre una zaranda orbital (HDL® Apparattus) a 160 rpm por 24 h (Vijayvergia et al., 2012). Transcurrido este tiempo las muestras se filtraron con cinco capas de papel de filtro. Posteriormente, el filtrado se colectó y evaporó en estufa a 40 °C hasta obtener un volumen final de un cuarto del inicial (Parekh y Chanda, 2006). Los extractos fueron conservados a 4 °C para los ensayos fitoquímicos y microbiológicos.
Caracterización fitoquímica
Contenido de azúcares reductores
El contenido de azúcares reductores se determinó por el método del ácido dinitrosalisílico (Miller, 1959). Se realizó una curva patrón con D-glucosa (1 mg ml-1) como azúcar patrón en un rango entre 0.1 y 1.0 g ml-1. Los valores de absorbancia se midieron a una longitud de onda de 456 nm en un espectrofotómetro Ultrospect 2000. Los ensayos fueron realizados por triplicado para cada extracto.
Determinación de fenoles
La cuantificación de fenoles se realizó en espectrofotómetro según procedimiento (Friend, 1992), 0.1 g de polvo se disolvieron en 1.0 ml de metanol y se agitó vigorosamente. La muestra se centrifugó a 12 000 rpm durante 10 min y el sobrenadante se colectó para la determinación de los fenoles solubles. Al precipitado se añadió 0.25 ml de hidróxido de sodio 2.0 mol l-1, se agitó vigorosamente y se colocó en una estufa a 70 °C durante 16 h. Posteriormente, la muestra se neutralizó con igual volumen de HCl 2.0 mol l-1, se centrifugó en iguales condiciones y se colectó el sobrenadante para la determinación de los fenoles ligados a la pared celular. A 0.1 ml de los extractos colectados, se le adicionaron 0.9 ml de agua destilada y 0.1 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu. La mezcla se dejó reposar durante cinco minutos, luego se agregaron 0.6 ml de una solución de NaOH 1.0 mol l-1 saturada con Na2CO3 y se incubó por 1 h a 25 °C para permitir el desarrollo del color. Se midieron las absorbancias a una longitud de onda de 725 nm. El contenido de compuestos fenólicos se expresó en mg de fenoles por g de masa seca (mg g-1 MS), referidos a una curva patrón de ácido clorogénico.
Presencia de metabolitos secundarios
Para la determinación de los metabolitos secundarios se utilizó la metodología descrita por Chigodi et al. (2013):
Antocianinas: se mezcló 1.0 ml de cada extracto con 3.0 ml de agua destilada y posteriormente se adicionó 1.0 ml de HCl 2.0 mol l-1 y de disolución amoniacal 0.5 mol l-1 a 1.0 ml de la mezcla anterior. La presencia de un color rosado-rojo que se torna azul-violeta indicó la presencia de antocianinas.
Terpenoides: se mezcló 1.0 ml de cada extracto con 1.0 ml de cloroformo (CHCl3) y a continuación se adicionaron 2.0 ml de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado. La coloración rojo-parda en la interfase indicó la presencia de terpenoides.
Flavonoides: se adicionó 1 ml de hidróxido de sodio (NaOH) 0.1 mol l-1 a 1.0 ml de cada extracto y posteriormente de agregó igual volumen de ácido clorhídrico (HCl) 0.1 mol l-1. La formación de un color amarillo en la disolución indicó la presencia de flavonoides.
Taninos: se mezcló 1.0 ml de cada extracto con 2.0 ml de agua destilada y la mezcla se calentó en un baño termostatado. Posteriormente se filtró con papel de filtro y al sobrenadante se adicionaron dos gotas de disolución de cloruro férrico al 1.0% en metanol. La presencia de taninos se identificó mediante la formación de un color verde oscuro en la disolución.
Saponinas: se mezcló 1.0 ml de cada extracto con 3.0 ml de agua destilada, se agitó con vigor y posteriormente la mezcla se calentó a 100 °C. La formación de espuma con pequeñas burbujas mostró la presencia de saponinas.
Antraquinonas: se mezclaron 2.0 ml de cada extracto con 3.0 ml de HCl al 10.0% (v/v) y la mezcla se calentó a 100 °C durante 3 min en baño termostatado. Posteriormente, se dejó enfriar a temperatura ambiente. Seguidamente se adicionó igual volumen de CHCl3 y a continuación unas gotas de disolución amoniacal al 10% y se volvió a calentar la mezcla. La formación de una coloración rosada indicó la presencia de antraquinonas.
Glucósido cardiotónico: se mezclaron 2.0 ml de cada extracto con 2.0 ml de ácido glacial acético que contenía una gota de disolución de cloruro férrico al 1.0%. A la mezcla se adicionó cuidadosamente 1.0 ml de H2SO4 concentrado por las paredes del tubo de ensayo. La presencia de desoxiazúcares característicos de los compuestos cardiotónicos, se observó por la formación de un anillo pardo en la interfase junto a un anillo púrpura por debajo.
Flobataninos: se mezcló 1.0 ml de cada extracto con una disolución de HCl al 2.0% y se calentó a 100 °C. La presencia de flobataninos se determinó por la formación de un precipitado rojo.
Esteroides: se mezcló 1.0 ml de cada extracto con 3.0 ml de CHCl3 y luego se agitó la mezcla. Posteriormente se adicionaron cuidadosamente 2.0 ml de H2SO4 concentrado por los lados del tubo de ensayo. La formación de un color rojo en la capa superior y una coloración verde en la capa de H2SO4 indicó la presencia de esteroides en el extracto.
Emodinas: se mezcló 1.0 ml de cada extracto con 1.0 ml de hidróxido de amonio (NH4OH) y 2.0 ml de benceno. La formación de una coloración roja indicó la presencia de emodinas.
Cumarinas: se mezcló 1.0 ml de cada extracto con 1.0 ml de NaOH al 10.0%. La formación de una coloración amarilla indicó la presencia de cumarinas en el extracto.
La presencia de los metabolitos se determinó de manera cualitativa a través del sistema no paramétrico de cruces (MINSAP, 1997). Presencia: (+++ =abundante, ++ = moderado, + =bajo, - = ausencia).
Actividad antibacteriana
Se evaluó la actividad antibacteriana del extracto etanólico frente a dos cepas de bacterias Gram positivas: Staphylococcus aureus ATCC 25923 y S. epidermidis ATCC 12228 y frente a una cepa de la bacteria Gram negativa Escherichia coli ATCC 25922. El ensayo se realizó en placas Petri mediante la técnica de difusión en pocillos (Pérez et al., 1990).
Las cepas bacterianas fueron previamente crecidas sobre medio de cultivo Agar Cerebro de Corazón a 37 °C durante 24 h. A partir de colonias aisladas se prepararon suspensiones bacterianas en disolución salina 0.85% (v/v) y se inoculó el medio de cultivo Agar Mueller- Hinton con una concentración celular de turbidez equivalente al tubo 0.5 de la escala de Mc Farland, con el empleo de un hisopo estéril. Los pocillos se hicieron con un horadador estéril de 8 mm de diámetro y se les adicionaron 100 µl de cada extracto. Las placas fueron incubadas toda la noche a 37 °C.
Para cada cepa bacteriana se emplearon como controles negativos etanol y agua y como control positivo el antibiótico ampicilina (100 mg ml-1). La actividad antibacteriana se determinó mediante la medición del diámetro de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano. Se realizaron tres réplicas de cada cepa.
Análisis estadístico
Los datos fueron procesados con el paquete Statgraphic plus 5.1 sobre Windows. Se determinó el ajuste a una Distribución Normal mediante la prueba de Bondad de Ajuste Kolmogorov-Smirnov y la Homogeneidad de Varianza mediante las Pruebas de Bartlett. En los casos en que los datos cumplieron los requisitos exigidos se procesaron mediante ANOVA de clasificación simple. Las diferencias entre las medias se contrastaron a través de prueba de Student-Newman-Keuls (p<0.05).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caracterización fitoquímica
Se observaron concentraciones elevadas de polifenoles en los extractos de hojas de H. patens, así como la presencia abundante o moderada de diferentes metabolitos secundarios como flavonoides, terpenos, esteroides, taninos, cumarinas y glucósidos cardiotónicos. Estos compuestos se observaron en mayores proporciones en el extracto etanólico en comparación con el metanólico (Tabla 1).
La presencia de polifenoles en extractos de hojas coincide con otros estudios fitoquímicos realizados en H. patens. En este sentido, Vijayvergia et al. (2011) y Jiménez-Suárez (2012) refirieron la presencia abundante de polifenoles en diferentes órganos de ponasí, aunque en concentraciones variables. La diferencia en contenido de estas sustancias pudo estar relacionada con varios factores como la época y el momento de colecta de las muestras, el estadio fisiológico de las plantas, el método de cosecha, el proceso de secado y el genotipo (Omodamiro et al., 2014; Habu y Ibeh, 2015).
De igual forma, en otras investigaciones realizadas con extractos metanólicos de ponasí se ha estimado un contenido similar de compuestos polifenólicos, los cuales fueron relacionados con las actividades antioxidantes determinadas en el extracto (Surana et al., 2016). La presencia de compuestos polifenólicos en el extracto de H. patens pudiera sugerir propiedades antioxidantes en esta especie, ya que varios trabajos refirieron una correlación entre la concentración de polifenoles y la actividad antioxidante (Cortés-Rojas et al., 2013; Keerthana et al., 2014; Mesa-Vanegas et al., 2015).
Las propiedades antioxidantes que tienen estas sustancias están dadas por la capacidad para reducir las especies reactivas del oxígeno (ERO) (Chahar y Sharma, 2017). Estos radicales atacan y modifican un rango amplio de macromoléculas que tienen funciones vitales a nivel celular como las enzimas, los ácidos nucleicos y los lípidos de membranas. Esto provoca cambios en las propiedades químicas y biológicas de estos compuestos y un mal funcionamiento a nivel celular, lo cual puede iniciar o exacerbar el desarrollo de enfermedades como el cáncer, las enfermedades neurodegenerativas, los procesos inflamatorios, las enfermedades cardiovasculares y el envejecimiento, entre otros (Mohammed y Abbas, 2016).
La presencia abundante o moderada de terpenoides, flavonoides, taninos, esteroides y cumarinas en los extractos de H. patens, también fue referida previamente por otros autores (Jiménez-Suárez et al., 2012; Surana y Wagh, 2015; Surana et al., 2016). Varios trabajos demuestran la naturaleza antioxidante de los compuestos flavonoides (Usunomena y Paulinus, 2016; Yi et al., 2016), por lo cual, la presencia de estas sustancias en los extractos de H. patens pudiera indicar un uso potencial de esta planta, para el tratamiento de numerosas enfermedades asociadas al estrés oxidativo (Patil et al., 2014; Salzanoa et al., 2014). Los flavonoides pueden eliminar las ERO ya sea por reducción de los radicales libres o por quelatación de metales de transición como el cobre y el hierro, que reaccionan con el peróxido de hidrógeno y forman otras especies más reactivas como el potente anión hidroxilo; el cual puede oxidar y modificar con facilidad la estructura de numerosas macromoléculas como las proteínas, los ácidos nucleicos y los lípidos de membrana, que tienen funciones importantes en la homeostasia celular (Stojiljković et al., 2014).
Además, a los flavonoides se les atribuyen otras funciones biológicas como antibacteriana y además, son considerados sustitutos potenciales de antibióticos (Cushnie y Lamb, 2005; Xie et al., 2015). También se les han atribuido a estos compuestos actividad anticancerígena. La acción citostática preventiva fue sugerida a través de su efecto sobre la transducción de señales durante la proliferación celular y la angiogénesis (Varshney et al., 2012; Pradhan, 2014).
De igual forma, las cumarinas pueden tener valor farmacológico, ya que debido a la naturaleza fenólica de estas sustancias, se ha informado de sus propiedades antibacterianas frente a patógenos Gram positivos y Gram negativos (Basile et al., 2009). Los taninos, por otra parte, representan un grupo de compuestos de gran importancia en la defensa de las plantas (Adamczyk et al., 2013). Estas sustancias interaccionan con proteínas ricas en prolina lo que provoca su inactivación, así como la inhibición de la biosíntesis proteica. Esta propiedad es lo relaciona a dichos compuestos con las propiedades antibacterianas y antifúngicas de algunas plantas (Zungu y Downs, 2015). Sin embargo, para corroborar las propiedades de estos metabolitos se requieren otros estudios de fraccionamiento, que permitan evaluar a estas sustancias de manera independiente y sinérgicamente.
Actividad antibacteriana
Los resultados mostraron el efecto antibacteriano del extracto etanólico de hojas de H. patens frente a las bacterias Gram positivas Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis (Tabla 2). Por el contrario, no se observaron diferencias significativas entre los controles negativos y el extracto con respecto a la inhibición de la bacteria Gram negativa Escherichia coli.
La diferencia observada en relación con las actividades antibacterianas frente a ambos grupos de microorganismos, pudo estar relacionada con la composición y complejidad de la pared celular de las bacterias así como por la concentración de los metabolitos en el extracto. Las bacterias Gram negativas, además de la capa de peptidoglicano poseen una capa de lipopolisacáridos que constituye una barrera adicional que dificulta la entrada de metabolitos de alto peso molecular con propiedades citotóxicas hacia el interior de la célula (Madigan et al., 2015). Estos resultados coinciden con los obtenidos por Abubacker et al. (2013) quienes refirieron un efecto antibacteriano de extractos de diferentes órganos de H. patens frente a diferentes especies de bacterias. En trabajos similares realizados por Okoye y Ezeogo (2016), también se obtuvo un efecto inhibitorio de extractos de esta planta frente a S. aureus, S. aeruginosa, Salmonella typhi y E. coli. Estos autores relacionaron la actividad antibacteriana con la presencia de varios metabolitos secundarios como taninos, alcaloides, saponinas, esteroides y flavonoides.
La actividad antibacteriana observada en la presente investigación puede estar asociada con algunos de los compuestos fitoquímicos presentes en el extracto evaluado, como taninos, flavonoides y terpenos (Cowan, 1999; Lawal et al., 2015). Los mecanismos inhibitorios se han vinculado con cambios en las propiedades físico-químicas de la membrana celular y la interferencia con procesos metabólicos vitales en los microorganismos patógenos. Los flavonoides pueden afectar el crecimiento microbiano por inhibición de la biosíntesis de ácidos nucleicos y otros procesos metabólicos; mientras que las sustancias de naturaleza terpenoide pueden interferir con la síntesis de los componentes de las membranas biológicas (Nayak et al., 2010).
De igual forma, los taninos y los compuestos fenólicos pueden inhibir el crecimiento bacteriano, debido a la capacidad que tienen estas sustancias de formar complejos irreversibles con proteínas, lo cual afecta sus propiedades biológicas y ocasiona la muerte de los microorganismos (Cowan, 1999). Los taninos también pueden disminuir la actividad de enzimas bacterianas mediante la quelatación de iones imprescindibles para la función catalítica de estos polipéptidos (Ojezele et al., 2016).
En el caso de la actividad frente a S. aureus, los resultados pueden ser importantes ya que a esta especie bacteriana se le atribuye su participación en la mayoría de las infecciones nosocomiales y además, se ha señalado en numerosos casos la resistencia a muchos antibióticos por este microorganismo (Okoye y Ezeogo, 2016). Por otra parte, los extractos de hojas de H. patens tienen la ventaja de que poseen una baja toxicidad en modelos de toxicidad aguda y subaguda, lo que justifica su uso en infecciones humanas y animales sin grandes riesgos para la salud (Alonso-Castro et al., 2015).
CONCLUSIONES
Los extractos de hojas de Hamelia patens Jacq. contienen diferentes compuestos bioactivos como terpenos, flavonoides, taninos, esteroides, cumarinas y polifenoles, los cuales poseen diferentes actividades biológicas y pueden estar relacionados con los usos etnobotánicos atribuidos a la especie. El extracto etanólico de hojas tiene actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis; lo que justifica, por una parte, el empleo tradicional de esta planta en el tratamiento de infecciones de la piel y además, indica un uso potencial de esta especie para el tratamiento de enfermedades de origen infeccioso. Sin embargo, es necesario realizar estudios posteriores que permitan determinar la efectividad de estos extractos en condiciones in vivo, así como su seguridad desde el punto de vista toxicológico.
Conflicto de intereses
Los autores no declaran conflicto de intereses.
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Recibido: 18-01-2018
Aceptado: 22-02-2018
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