CRISPR/Cas: aplicaciones y perspectivas para el mejoramiento genético de plantas

Mairenys Concepción-Hernández

Reseña bibliográfica

Biotecnología Vegetal Vol. 18, No. 3: 135 - 149, julio - septiembre, 2018

Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.

eISSN 2074-8647, RNPS: 2154

CRISPR/Cas: aplicaciones y perspectivas para el mejoramiento genético de plantas

CRISPR/Cas: applications and perspectives for plant genetic improvement

Mairenys Concepción-Hernández

Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: mairenys@ibp.co.cu

RESUMEN

El desarrollo vertiginoso de la tecnología CRISPR/Cas en los últimos años, desde su descubrimiento como sistema inmune microbiano hasta su evolución como herramienta versátil y potente para la modificación de la función génica, constituye un manifiesto sobre cómo investigaciones básicas de impacto moderado pueden revolucionar las investigaciones biológicas. A partir de su aplicación como plataforma para la edición génica guiada por ARN, el sistema CRISPR/Cas se ha extendido hacia campos tan diversos como la regulación de la expresión génica, edición del epigenoma y visualización in vivo de la cromatina. En este artículo se introduce la tecnología CRISPR/Cas con énfasis en el sistema de tipo II CRISPR/Cas9 y se discuten sus principales aplicaciones en el mejoramiento genético en plantas. Igualmente, se destacan los avances y limitaciones del uso de la tecnología en plantas, y se delinean las futuras perspectivas en el campo del mejoramiento genético.

Palabras clave: edición de genoma, estrés biótico y abiótico, ingeniería genética, modificación de función génica

ABSTRACT

The rapid development of CRISPR/Cas technology in recent years, from its discovery as a microbial immune system to its evolution as a versatile and powerful tool for the modification of gene function, constitutes a statement on how basic research with a moderate impact can revolutionize biological investigations. From its application as a platform for RNA-guided gene editing, the CRISPR/Cas system has spread to fields as diverse as the regulation of gene expression, epigenome editing, and in vivo visualization of chromatin. In this article the CRISPR/Cas technology is introduced, with emphasis on the CRISPR/Cas9 type II system and its main applications in plant breeding are discussed. Likewise, advances and limitations in the use of this technology in plants are highlighted, and future perspectives in the field of genetic improvement are outlined.

Keywords: abiotic and biotic stress, gene function modification, genetic engineering, genome

INTRODUCCIÓN

La obtención de cultivares que permitan enfrentar la creciente demanda de alimento seguro para humanos y animales, así como la proveniente de las diversas aplicaciones industriales de las plantas, requiere de técnicas de mejoramiento genético versátiles, eficientes y rápidas.

La manipulación de la función génica es una herramienta básica en la obtención de cultivares mejorados. Esta ha sido utilizada por los programas de mejoramiento genético tradicional a través de la incorporación de mutaciones naturales o inducidas en genotipos élites. A pesar de ser exitoso en la obtención de numerosas variedades, este enfoque es impreciso, trabajoso y azaroso. El desarrollo de las técnicas de secuenciación de ADN unido al aumento de la capacidad de procesamiento de los sistemas informáticos ha favorecido la disponibilidad de los genomas y transcriptomas de un número siempre creciente de organismos. La acumulación de estudios moleculares, morfológicos y fisiológicos en plantas permitió la implementación de sistemas para la mutación dirigida, que requieren de un conocimiento profundo del proceso a modificar. El empleo de nucleasas específicas de sitio para la mutagénesis dirigida en plantas constituyó el siguiente paso en la evolución de las técnicas de precisión para la modificación de la función génica.

Hasta el año 2013 las herramientas para edición de genoma más utilizadas eran las nucleasas dedos de cinc (del inglés: Zinc Finger Nucleases, ZFN, Kim et al., 1996) y las nucleasas tipo activadores de transcripción (del inglés: Transcription Activator-like Effector Nuclease, TALEN, Christian et al., 2010). Ambas técnicas se basan en el empleo de proteínas de fusión que contienen un dominio manipulado artificialmente de unión al ADN, fusionado al dominio nucleasa de una enzima de restricción como FokI. Esta endonucleasa produce cortes en la doble cadena de ADN, los que son altamente tóxicos para la célula y se han de reparar. Este tipo de lesión se repara mediante los mecanismos de unión de extremos no homólogos (del inglés: NHEJ, non homologous end joining) y la recombinación homóloga (RH), los cuales generan variabilidad. La preferencia por un mecanismo u otro y sus resultados varía entre especies y tipo celular, siendo NHEJ la vía favorecida en las células vegetales, en las que el mecanismo de RH es más ineficiente en comparación con las células animales (Bortesi et al., 2016). Como resultado de la reparación vía NHEJ se producen inserciones y deleciones aleatorias en la región del corte, siendo más frecuentes las deleciones de hasta 10 pb e inserciones de 1 pb. Por otro lado, la reparación vía RH emplea como molde una molécula de ADN homóloga, la que puede ser suministrada con el sistema, y facilitar la introducción de pequeñas modificaciones en la secuencia original, o la inserción precisa de un segmento de ADN foráneo. Además, la sustitución del dominio nucleasa por activadores o represores de la transcripción, genera un amplio espectro de posibilidades para la modulación de la expresión génica en plantas. En estos sistemas, el reconocimiento de la secuencia del ADN blanco se realiza por interacción de las respectivas bases nitrogenadas con los residuos aminoacídicos de la proteína, lo que dificulta y enlentece su diseño.

En 2013 surgió una nueva herramienta para la edición génica denominada CRISPR/Cas (Cho et al., 2013; Cong et al., 2013; Hwang et al., 2013; Jinek et al., 2013; Mali et al., 2013). Desde entonces, el número de publicaciones relacionadas aumentó exponencialmente en unos pocos años, hasta triplicar en 2015 las generadas por los métodos ZFN y TALEN unidos. Este desarrollo vertiginoso se debe a que el nuevo método es de ensamblaje sencillo y rápido, menos costoso y ofrece la capacidad de multiplexing o mutar varios genes simultáneamente, con el empleo de múltiples ARN guías (gARN) y una única nucleasa Cas. Adicionalmente, el sistema CRISPR/Cas se basa en el reconocimiento de la secuencia blanco mediante un ARN complementario, a diferencia de los métodos anteriores. En este artículo se describe el empleo del sistema CRISPR/Cas y se discuten las potencialidades y limitaciones de uso en el mejoramiento genético de plantas.

Sistema CRISPR/Cas: Orígenes y características

En 1987 un grupo de investigadores de la Universidad de Osaka, Japón, informó el descubrimiento de cinco repeticiones directas de 29 nucleótidos espaciadas por 32 nucleótidos en el genoma de Escherichia coli, cuya función biológica era desconocida (Ishino et al., 1987). Años más tarde se indicó la presencia de estas repeticiones en otras especies de bacterias y Archaea como Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena sp. PCC 7120 y Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al., 1993; Mojica et al., 1995; Masepohl et al., 1996; Hoe et al., 1999). El término CRISPR (del inglés: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) fue acuñado para designar a estas secuencias repetidas y se traduce al español como repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (Jansen et al., 2002). Estos investigadores identificaron además la presencia de genes asociados a CRISPR que denominaron cas (del inglés: CRISPR-associated). Así, un locus CRISPR consiste en repeticiones directas cortas separadas por secuencias denominadas espaciadores y flanqueadas por diversos genes cas (Barrangou et al., 2007). En 2007, se demostró experimentalmente que estas secuencias forman parte de un sistema inmune adaptativo (Barrangou et al., 2007). En este estudio, se adicionaron o eliminaron diferentes espaciadores a cepas de Streptococcus thermophilus lo que modificó su fenotipo de resistencia a fagos. Además, se confirmó mediante knock-out la participación de los genes cas en la resistencia a fagos y que ésta está determinada por la similitud de secuencias entre espaciadores y ADN viral. El funcionamiento del sistema CRISPR/Cas en bacterias fue dilucidado en numerosos microorganismos y se determinó que provee, además, protección específica de secuencia contra ADN foráneo plasmídico (Marraffini y Sontheimer, 2008), y en algunos casos ARN (Abudayyeh et al., 2016).

La inmunidad conferida por el sistema CRISPR/Cas consta de tres etapas mecanísticas: adaptación, expresión e interferencia. Al producirse la entrada de ADN foráneo a la célula bacteriana, a causa de una infección viral o mediante transfección, este es reconocido, cortado en pedazos y los fragmentos obtenidos son incorporados al locus CRISPR en el ADN genómico de la bacteria. Durante este proceso se incorporan al azar diferentes fragmentos, lo que aumenta las posibilidades de adaptación del hospedante ante futuras infecciones del virus o plásmido correspondiente. Durante la etapa de expresión, el clúster CRISPR produce varios ARN CRISPR (crARN) de aproximadamente 40 nucleótidos de longitud que contienen el motivo protoespaciador adyacente (PAM), complementario al sitio de ADN foráneo y que permite a la célula distinguir entre ADN propio y no propio (van der Oost et al., 2014). La hibridación de este crARN con el crARN transactivador (tracrARN) forma el ARN guía (gARN). El tracrARN es transcrito a partir de una secuencia adyacente al locus CRISPR y es esencial para el procesamiento del crARN y para el corte de ADN por el complejo de la nucleasa Cas9 (Jinek et al., 2012).

En la etapa de interferencia, el gARN es reconocido por el complejo efector, que es dirigido por la complementariedad de bases entre 20 nucleótidos del extremo 5´ del gARN y el ADN blanco. El corte del ADN foráneo requiere la presencia del motivo PAM hacia el extremo 3´ de la secuencia blanco. La secuencia PAM de la conocida Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) es 5ʹ‑NGG‑3ʹ, donde N puede ser cualquiera de los cuatro nucleótidos (Mojica et al., 2009). En algunos bacteriófagos se observó que mutaciones puntuales en la secuencia PAM evitaron su identificación por la nucleasa Cas, lo que permitió la evasión del sistema CRISPR/Cas (Bondy-Denomy et al., 2013).

Existe gran diversidad entre los sistemas CRISPR/Cas descritos en cuanto a la composición de proteínas, arquitectura del locus, estructura del complejo efector y su mecanismo de acción. Makarova et al. (2015) propusieron una clasificación que dividía los sistemas CRISPR/Cas en dos clases principales de acuerdo con el análisis de las familias de proteínas y a las características de los loci CRISPR. La Clase I contiene complejos de efectores con múltiples subunidades mientras que en la Clase II las funciones del complejo efector son realizadas por una única proteína multidominios de gran tamaño como es Cas9. La Clase I contiene los sistemas de tipo I que son más comunes y diversos, los sistemas de tipo III más abundantes en arqueas, así como los sistemas de tipo IV que carecen del módulo de adaptación. La Clase II incluye los bien caracterizados sistemas de tipo II que incluyen la endonucleasa efectora Cas9, utilizada ampliamente en la edición de genomas. Además, contiene los sistemas de tipo V que han sido probados experimentalmente e incluyen las proteínas efectoras Cas12a–e (Shmakov et al., 2017). Estas proteínas poseen un dominio RuvC que corta la simple cadena de ADN, excepto Cas12a (también Cpf1) que tiene además un dominio catalítico que participa en el procesamiento del pre-crARN (Fonfara et al., 2016). Por otra parte, los sistemas efectores de tipo VI contienen dos dominios HEPN de posible actividad RNAsa (Koonin et al., 2017). La descripción de sistemas que no se ajustan a la clasificación anterior indica que aún existen nuevos tipos y subtipos por clasificar.

Solo los sistemas de Clase II han sido adaptados para la modificación de genomas, en particular, el sistema CRISPR/Cas9. La disección de sus componentes permitió determinar que el sistema de interferencia por CRISPR/Cas requiere como elementos necesarios y suficientes la nucleasa Cas9, el crARN y el tracrARN (Jinek et al., 2012). Adicionalmente, estos investigadores redujeron los elementos del sistema a la nucleasa Cas9 y un ARN de guía única donde se fusionan el crARN y el tracrARN llamado ARN de guía única (sgARN). La funcionalidad del sgARN fue demostrada en eucariontes (Cho et al., 2013; Hwang et al., 2013; Jinek et al., 2013) mientras que Cong et al. (2013) y Mali et al. (2013) mostraron además, que se podían editar múltiples loci mediante el uso de diferentes sgARN. Desde entonces, se ha optimizado la eficiencia de los sgARN en el cultivo de células y se han diversificado sus aplicaciones. Así, un diseño eficiente para la edición de genomas incluye una larga cola de tracrARN que contiene la horquilla 3ʹ nativa y una extensión de 5 pb del dúplex crRNA–tracrRNA (Chen y Doudna, 2017). Actualmente, el sistema CRISPR/Cas9 se ha constituido en una plataforma universal para la modificación del genoma guiada por ARN.

La enzima Cas9

La proteína Cas más utilizada hasta la fecha para la edición de genomas es SpCas9, que es una endonucleasa multidominios y multifuncional de gran tamaño (1 368 aa). La estructura cristalina de los subtipos principales SpCas9 y AnaCas9 (Actinomyces naeslundii) de esta enzima muestran un núcleo funcional conservado que contiene los dominios endonucleasa, una región rica en arginina y un dominio de topohomología, con dominios α-hélice y C-terminal divergentes (Jinek et al., 2014). En otro estudio, la estructura del complejo Cas9-sgARN-ADN blanco reveló una organización bilobular, compuesta por un lóbulo α-hélice de reconocimiento (REC) y un lóbulo nucleasa (NUC) que contiene los dominios HNH, subdominios RuvC ensamblados, y una región C-terminal que interactúa con el PAM (PI) (Nishimasu et al., 2014). Estos dos estudios muestran una conformación de autoinhibición de la apoenzima (enzima inactiva) en que el dominio RuvC bloquea el sitio activo del dominio HNH. Asimismo, se observó que existen impedimentos estéricos para la unión del heterodúplex gARN-ADN a la apoenzima, por lo se propuso que Cas9 se pliega y organiza alrededor del gARN (Nishimasu et al., 2014). Por otro lado, la región rica en arginina está conservada entre las proteínas Cas9 y es crítica para el reconocimiento sgARN:ADN.

El reconocimiento del sitio PAM en SpCas9 es realizado por dos residuos de arginina del sitio PI. Mediante experimentos con moléculas simples, Sternberg et al. (2014) demostraron que el complejo Cas9-sgARN se une a la molécula blanco mediante una secuencia PAM. En este trabajo se definió el papel de la denominada región “semilla” del crARN, que define la especificidad en el reconocimiento de la secuencia blanco. Se observó que la ocurrencia de desapareamientos en los 10-12 nucleótidos próximos al sitio PAM hacia el extremo 3’ del crARN impide la unión del ADN blanco y el corte por la Cas9 en los sistemas CRISPR de tipo II. Adicionalmente, los cortes off-target (fuera de la región deseada) aumentan en secuencias con alta homología con la secuencia “semilla” (Pattanayak et al., 2013). El tiempo que permanece unida la enzima depende de la complementariedad de bases con el gARN, y esta se disocia rápidamente del ADN que no contiene sitios PAM (Knight et al., 2015).

La enzima Cas9 produce dos cortes que generan extremos romos en la doble cadena de ADN, tres bases arriba del extremo 3´ del PAM mediante la actividad nucleasa de los dominios HNH y RuvC. El dominio HNH corta la cadena complementaria al gARN mientras que el dominio RuvC corta la cadena no complementaria. En la enzima SpCas9, el sitio catalítico del dominio HNH contiene tres residuos aminoacídicos (Asp839, His840 y Asn863) mientras que el dominio RuvC tiene los residuos Asp10, Glu762, His983 y Asp986 (Anders et al., 2014, Nishimasu et al., 2014). Una revisión detallada sobre el reconocimiento y corte de la secuencia blanco mediado por Cas-ARN desde un enfoque mecanístico y estructural es brindado por Jiang y Doudna (2017).

SpCas9 reconoce la secuencia PAM 5´-NGG-3´ y con menos especificidad la 5´-NAG-3´ (Nakade et al., 2017). Sin embargo, esta secuencia no siempre se encuentra con facilidad en la cercanía de la secuencia blanco, sobre todo si es una región rica en AT. De igual manera, el gran tamaño de la proteína Cas9 (1 368 aa), unido a la generación de mutaciones inespecíficas de difícil predicción por los análisis de similitud de secuencias, limitan las aplicaciones de SpCas9. Por tanto, varios estudios se han enfocado en la identificación y empleo de homólogos pertenecientes a otras bacterias y la descripción de nuevos sistemas CRISPR/Cas que superen las limitaciones anteriores. Hasta la fecha se han utilizado en la edición de genomas más de diez proteínas Cas diferentes. Entre estas, destacan Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9, 1053aa) (Mojica et al., 2009), Neisseria meningitides (NmCas9, 1082 aa) (Hou et al., 2013) y Campylobacter jejuni (CjCas9, 984 aa) (Kim et al., 2017). A pesar de ser más pequeñas, estas proteínas son menos flexibles en su acción que SpCas9, debido a que utilizan sitios PAM más complejos. Otro descubrimiento interesante fue el de las enzimas Cpf1 de Clase II tipo V, que al igual que Cas9 cortan el ADN blanco por complementariedad con un ARN guía (Zetsche et al., 2015). Estas enzimas requieren un único ARN guía y reconocen sitios PAM ricos en timina, en contraste con los sitios PAM ricos en guanina de Cas9. Notablemente, Cpf1 contiene el dominio endonucleasa RuvC y otro nuevo dominio endonucleasa (Yamano et al., 2016) que generan extremos 5’ protuberantes (Zetsche et al., 2015) a diferencia de los extremos romos generados por Cas9 (Garneau et al., 2010).

Numerosos trabajos han estado dirigidos a la obtención de variantes mejoradas de Cas9 con un aumento de su fidelidad y mayor versatilidad. Dos variantes de SpCas9, eSp-Cas9 (Slaymaker et al., 2016) y SpCas9-HF (Kleinstiver et al., 2016) fueron obtenidas a través de mutaciones que minimizaban la interacción de la proteína con el ADN blanco, lo que provocó un aumento de la especificidad. De igual manera, se han probado funcionalmente variantes de SpCas9, obtenidas mediante evolución molecular, con diferente reconocimiento de la secuencia PAM como VQR, EQR y VRER (Kleinstiver et al., 2015). La primera variante reconoce la secuencia 5´-NGAN-3´ con afinidades que varían en el siguiente orden NGAG > NGAT = NGAA > NGAC. La segunda variante reconoce la secuencia 5’-NGAG-3’ y la tercera la secuencia 5’-NGCG-3’. La variante FnCas9 RHA: E1369R/E1449H/R1556A de Francisella novicida requiere la secuencia PAM más corta conocida 5’-YG-3’ donde Y puede ser C o T (Hirano et al., 2016). El uso de estas variantes, sin embargo, pudiera complejizar los experimentos y comprometer la eficiencia por la especificidad.

Entre las modificaciones realizadas a Cas9 se distingue la obtención de mutantes de las actividades nucleasas de los dominios HNH, RuvC o de ambos. La mutación de uno de los dominios, genera una “nicasa” (nCas9) que produce un corte en la simple cadena de ADN y favorece la vía de reparación por RH (Jinek et al., 2012). En cambio, cuando se mutan los dos dominios, se obtiene la denominada “dead” Cas9 (dCas9, Qi et al., 2013), sin actividad nucleasa y que en unión a otros dominios puede emplearse en la activación y represión de la transcripción (Garneau et al. 2010; Sander y Joung, 2014).

De especial relevancia es el uso de la nCas9 fusionada a enzimas modificadoras de bases nitrogenadas en lo que se conoce como herramientas de segunda generación para la edición de genomas, al ser capaces de modificar bases nitrogenadas sin introducir cortes en la doble cadena de ADN. Este campo ha recibido gran atención por las numerosas posibilidades que brinda. Así se logra la conversión de C a T, o A a G (Komor et al., 2016; Gaudelli et al., 2017), lo que permite alterar el código genético, e incluso introducir codones de parada prematuros en los genes (Kuscu et al., 2017).

Adicionalmente, el uso de dos sgARN diferentes para realizar un doble corte en conjunto con nCas9 (Mali et al., 2013, Ran et al., 2013) o con dCas9 fusionado con FokI (Guilinger et al., 2014, Tsai et al., 2014) se ha utilizado con éxito para disminuir los off-target en células de mamíferos. Esta estrategia tiene como limitante que reduce significativamente los sitios de corte disponibles en la secuencia de interés al emplear dos sgARN.

Aplicaciones de CRISPR/Cas en biotecnología vegetal

Las potencialidades del sistema CRISPR/Cas para la biología y el mejoramiento genético de plantas fueron comprendidas rápidamente por los investigadores y en 2013 aparecieron las primeras publicaciones al respecto (Li et al., 2013; Nekrasov et al., 2013; Shan et al., 2013).

Particularidades del sistema CRISPR/Cas en plantas

A diferencia de las células animales, en las plantas la pared celular constituye un obstáculo físico entre la secuencia blanco y los componentes del sistema CRISPR, la proteína Cas, el gARN y ADN donante para la recombinación homóloga, por lo que el sistema empleado de entrega de estos componentes determina la eficiencia del proceso. Así, existen varios sistemas de entrega que permiten la expresión transitoria del gen cas9 y los sgARN, la co-transformación estable de cas9 y los sgARN o variantes combinadas de las anteriores.

La transformación genética con un vector que contiene el gARN y el gen cas9 permite la obtención de plantas que expresan de forma estable o transitoria estos genes. El empleo de la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens se ha logrado en múltiples especies de plantas, y posee como ventajas fundamentales la incorporación de un número bajo de copias del gen de interés y ser de aplicación fácil y poco costosa, por lo que constituye el método más utilizado.

El empleo de la microinyección, bombardeo de partículas y transformación de protoplastos mediante polietilenglicol (PEG) se utilizan en especies donde la transformación con A. tumefaciens no es posible.

El uso exitoso del CRISPR/Cas en plantas requiere además de la optimización de codones y el uso de promotores adecuados para Cas, así como del sgARN, y de la adición de una señal de localización nuclear. Generalmente, la expresión de sgARN es regulada por promotores de la ARN polimerasa III como AtU6, TaU6, responsables de la expresión de ARN de pequeño tamaño. Igualmente, el gen cas9 se sitúa bajo la acción de promotores de ARN polimerasa II que guían la expresión de ARN de mayor tamaño, como 35S y ubiquitina.

Dado su origen bacteriano, la expresión de la proteína Cas en el tejido vegetal no es siempre eficiente, de ahí que se han generado múltiples versiones con optimización del uso codones para varias especies, tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas. La mayoría de los trabajos utilizan versiones de SpCas9 con codones optimizados para humanos (Li et al., 2013; Miao et al., 2013) o plantas (Feng et al., 2013; Nekrasov et al., 2013; Xie y Yang, 2013).

Adicionalmente, el sistema de expresión, los sitios de restricción disponibles y los objetivos de la investigación determinan el tipo de vector a utilizar. Así, diferentes plásmidos pueden ser estudiados en el sitio https://www.addgene.org/crispr/plant/.Esto se ve favorecido con la creciente disponibilidad de vectores que contienen el sistema con diversas posibilidades para su clonaje como los sistemas Gateway y ensamblaje de Gibson" . Esto se ve favorecido con la creciente disponibilidad de vectores que contienen el sistema con diversas posibilidades para su clonaje como los sistemas Gateway y ensamblaje de Gibson.

Los vectores virales se han empleado con éxito para la transferencia de ADN a células animales y vegetales. Sin embargo, su uso con los componentes del sistema CRIPR/Cas9 está limitado por el gran tamaño de la proteína Cas9, lo que dificulta su empaquetado. Una de las aplicaciones más atractivas de los vectores virales es la entrega del ADN molde para la reparación por RH, debido a que garantiza altas concentraciones del mismo (Wang et al., 2017).

El uso de complejos ribonucleoproteicos (RNP) Cas9-sgRNA pre-ensamblados in vitro constituye una alternativa a esta situación y posee como ventaja que no involucra la integración de un transgén o la inserción de fragmentos de ADN en los nuevos mutantes. En este sentido, Woo et al. (2015) lograron la mutagénesis dirigida mediante transfección de protoplastos de Arabidopsis thaliana L. Heynl, Nicotiana tabacum L., Lactuca sativa L., y Oryza sativa L. con RNP Cas9-sgRNA y el uso de PEG. Posteriormente, Svitashev et al. (2016) obtuvieron plantas de maíz (Zea mays L.) con alelos mutados a través del bombardeo de embriones inmaduros con RNP. Otro grupo (Liang et al., 2017) utilizó una estrategia idéntica para editar embriones inmaduros de trigo (Triticum aestivum L.). En ambos trabajos se mostró la reducción de los efectos off-target en comparación con células transfectadas con ADN, posiblemente debido a la disminución del tiempo de acción del RNP, que es degradado rápidamente en la célula vegetal. Esto último, sin embargo, resulta una limitante del empleo de RNP cuando se requiere la expresión estable o alta de los componentes del sistema CRISPR.

Por otra parte, el diseño del gARN es crítico al afectar la eficiencia y la especificidad del sistema CRISPR/Cas. Varios softwares está disponibles para el diseño de gARN, que utilizan información de los genomas publicados por especies para la predicción de off-targets de cada gRNA. Así mismo debe considerarse la presencia de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción en la secuencia a modificar que facilite el análisis de los resultados de la edición. Aunque el empleo de un único sgARN permite la obtención de modificaciones, se ha propuesto que la eficiencia de edición aumenta al emplear un mayor número de secuencias guía.

Métodos de detección de las modificaciones producidas por el sistema CRISPR/Cas

Las mutaciones generadas por el sistema CRISPR/Cas9 pueden ser de varios tipos: heterocigóticas, homocigóticas o bialélicas (mutaciones alélicas diferentes). Los métodos para su detección son numerosos y han sido considerados anteriormente por Zischewski et al. (2017). Entre los más empleados se encuentra el método de PCR suprimido por digestión con enzima de restricción (RE-PCR, del inglés: restriction enzyme digestion suppressed PCR), que identifica las mutaciones introducidas por NHEJ (Xie y Yang, 2013). Otros métodos hacen uso de nucleasas que identifican la presencia de desapareamientos en la molécula de ADN debido a inserciones/deleciones o sustituciones de bases nitrogenadas, como T4E7 y T7E1 de origen viral. Las variantes de origen vegetal de estas enzimas son conocidas como “surveyor”, y producen un corte con alta especificidad en el extremo 3´ del sitio de desapareamiento (Vouillot et al., 2015). Los métodos anteriores permiten la detección de mutaciones mediante electroforesis en gel de agarosa. Otra alternativa para la detección de mutantes es la secuenciación por el método de Sanger de un fragmento de PCR que incluya las regiones que se deseaban modificar. La secuenciación total del genoma mediante técnicas de próxima generación (Next generation sequencing) permite además detectar la ocurrencia de off-targets.

Mejoramiento genético

La edición de genoma por CRISPR/Cas se ha utilizado en plantas para aumentar el rendimiento, la resistencia a microorganismos patógenos, el valor nutricional y la tolerancia a estrés abiótico.

Mejoramiento a estrés biótico y abiótico

El número de plantas resistentes obtenidas con la tecnología CRISPR/Cas aumenta cada año (Tabla 1).

La mutación de genes de susceptibilidad, que facilitan la compatibilidad planta-patógeno, podría proveer una resistencia más duradera y de amplio espectro que la conferida por genes de resistencia (van Schie y Takken, 2014). Ejemplo de esto lo constituye el empleo de mutantes del gen de susceptibilidad mlo en cebada por más de 50 años en campo y con resistencia al oídio (Blumeria graminis f. sp. hordei) (Freisleben y Lein, 1942). Estos genes muestran un papel en la susceptibilidad a microorganismos patógenos que se conserva tanto en plantas dicotiledóneas como monocotiledóneas. Así, Nekrasov et al. (2017) editaron el gen SlMlo1 de tomate mediante el uso de dos sgARN. Las plantas modificadas de la generación T0 mostraron deleciones de 48 pb mientras que su progenie mostró resistencia a Oidium neolycopersici sin afectaciones en la morfología de la planta y rendimiento del fruto.

Por otro lado, Wang et al. (2014) lograron la modificación simultánea de tres alelos homólogos del gen TaMlo-A1 de trigo. Este trabajo demostró, además, la factibilidad del uso del sistema CRISPR en especies poliploides como es el caso del trigo hexaploide.

Es destacable que el silenciamiento de este gen incrementó la resistencia a M. oryzae (Wang et al., 2016). Las líneas mutadas libres del transgén pertenecientes a las generaciones T1 y T2 mostraron una disminución de la incidencia de la enfermedad y sus características agronómicas no resultaron afectadas. Estas líneas fueron seleccionadas mediante segregación.

El gen OsERF922 es un regulador negativo de la inmunidad de O. sativa frente Magnaporthe oryzae (Liu et al., 2012). Wang et al. (2016) utilizaron un sgARN para obtener mutantes con cambios en el marco de lectura de este gen.

de Toledo et al. (2016) generaron plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) que presentaban mutaciones que afectaban el sitio activo de la enzima SlDMR6. Una de las líneas obtenidas mostró resistencia parcial y de amplio espectro frente a tres bacterias diferentes (Xanthomonas gardneri Xg153, Xanthomonas perforans Xp4b, Pseudomonas syringae DC3000) y el oomicete Phytophthora capsici LT1534.

El factor de iniciación eIF4E participa en la traducción del ARNm en eucariontes y a la vez está relacionado con la resistencia recesiva a virus. Recientemente, Chandrasekaran et al. (2016) utilizaron CRISPR/Cas9 para mutar dicho gen y aumentar la resistencia a los virus Cucumber vein yellowing virus (Ipomovirus) y los potivirus Zucchini yellow mosaic virus y Papaya ring spot mosaic virus-W, en plantas de pepino (Cucumis sativus L.). Debido a la naturaleza recesiva de este tipo de resistencia solo los mutantes homocigóticos mostraron un aumento en la resistencia.

Por otro lado, Peng et al. (2017) modificaron el promotor del gen de susceptibilidad CsLOB1 y aumentaron la resistencia a Xanthomonas citri subsp. citri. En este estudio el 42% de las plantas mutantes tenían las modificaciones deseadas y de estas, el 23.5% mostró resistencia a la enfermedad.

La productividad de los cultivos a nivel mundial está limitada por la existencia de condiciones ambientales adversas como déficit hídrico, altas temperaturas, elevada salinidad y baja calidad nutricional de los suelos. Sin embargo, el uso de CRISPR/Cas en la obtención de variedades tolerantes a estrés biótico tiene potencialidades aun no explotadas por los mejoradores.

Osakabe y Osakabe (2017) mostraron la mutación del gen de respuesta a estrés abiótico OST2/AHA1 mediante el uso de gARN truncados (tru-gRNA) y Cas9 guiada por el promotor específico de tejido AtEF1 en A. thaliana. Los mutantes homocigóticos obtenidos mostraron un aumento en la respuesta estomática y menor pérdida de agua que las plantas no mutadas.

Ingeniería metabólica

Otro campo de múltiples posibilidades de aplicación de CRISPR/Cas es la ingeniería metabólica en plantas. Al permitir la manipulación de varios genes a la vez, la edición por CRISPR/Cas es ideal para intervenir rutas metabólicas compuestas en su mayoría por un número elevado de productos génicos.

Por ejemplo, Alagoz et al. (2016) manipularon la vía de biosíntesis de alcaloides bencilisoquinolínicos en Papaver somniferum L. mediante la edición del gen 4´OMT2, lo que provocó cambios en el perfil de alcaloides derivados de esta ruta metabólica. En otro estudio, Li et al. (2017) modificaron el gen de la diterpeno sintasa (SmCPS1) que participa en la biosíntesis de tanshinone en Salvia miltiorrhiza Bunge, una planta medicinal. Los mutantes homocigóticos se obtuvieron mediante transformación con Rhizobium rhizogenes y no mostraron acumulación de tanshinone.

Recientemente, Tang et al. (2017) desarrollaron líneas de arroz con knock-out del gen OsNramp5 que codifica para un transportador de metales. Estas líneas mostraron una baja acumulación de cadmio en los granos sin afectaciones en su rendimiento. Este trabajo muestra una aplicación práctica de la tecnología para la producción de alimentos con menor riesgo de contaminación.

Perspectivas, limitaciones y cuestiones éticas

La tecnología CRISPR/Cas avanza rápidamente, y entre las principales líneas de investigación se encuentra el aumento de la eficiencia y la disminución de los efectos off-target. Las principales estrategias para la reducción de off-targets incluyen modificaciones en el tamaño del sgARN, el empleo de RNP y la modificación de la proteína Cas (mutaciones puntuales, nicasas apareadas y nicasas dimerizadas) y de su concentración (Hsu et al., 2013). Por otro lado, la mayoría de las investigaciones emplean el silenciamiento de genes mediante la reparación por NHEJ, mientras que la mutagénesis dirigida a través de RH resulta un desafío por su baja probabilidad de ocurrencia en plantas y las dificultades para la transferencia de sus componentes al núcleo de la célula vegetal (Steinert et al., 2016). Sin embargo, se han comenzado a dar algunos pasos de avance en este sentido. Gil‐Humanes et al. (2017) describieron el uso de una versión deconstruida del Virus del enanismo del trigo para la mutación simultánea de tres homoalelos del gen de ubiquitina, con una frecuencia aproximada del 1%.

Otra línea de avance vertiginoso de las investigaciones en CRISPR/Cas es el empleo de variantes modificadas de la proteína Cas9 como dCas9, y proteínas de fusión a Cas9. dCas9 puede utilizarse como represor de la transcripción, sin embargo, puede fusionarse a otros represores y activadores con diferencias en su actividad (Piatek et al., 2015). La fusión de Cas9 con acetiltransferasas o metilasas de histonas ha permitido la activación y represión, respectivamente, de la transcripción de los genes blancos (Hilton et al., 2015; Choudhury et al., 2016). Otra variante atractiva es el uso de sondas fluorescentes con dCas9 para el marcaje in situ de ADN y las fusiones con proteínas fluorescentes para el estudio in vivo de la dinámica de los cromosomas (Chen et al., 2013). Sin embargo, estas variantes no han sido desarrolladas completamente en plantas.

En 2016 el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos no reguló el cultivo y comercialización del champiñón (Agaricus bisporus) modificado por CRISPR/Cas9 para evitar su fenolización (Waltz, 2016). Este pronunciamiento de una agencia reguladora permite disminuir considerablemente el tiempo y los costos asociados a la salida al mercado de los productos generados por CRISPR/Cas. Las posibilidades que esta tecnología brinda para la generación de conocimientos y productos de interés agrícola, reclaman la atención de la comunidad científica, las compañías productoras de alimentos y los organismos creadores de políticas. El sistema CRISPR/Cas resulta especialmente significativo para los países en vías de desarrollo, como un útil instrumento en la búsqueda de soluciones a las crisis alimentarias, los efectos del cambio climático y la dependencia tecnológica de estas naciones.

CONCLUSIONES

El sistema CRISPR/Cas ha revolucionado en pocos años la biología molecular, la medicina y la biotecnología. Este constituye además una valiosa herramienta para el mejoramiento genético de plantas frente a microorganismos patógenos, si se considera la dinámica de las interacciones y las dificultades de los mejoradores de plantas en la obtención de información relevante sobre los mecanismos moleculares involucrados en la resistencia y susceptibilidad, la modificación de genes en un tiempo breve.

La identificación y descripción de sistemas CRISPR ahora desconocidos advierte el descubrimiento de nucleasas con diferentes especificidades, y de nuevos conocimientos sobre la inmunidad en microorganismos. CRISPR/Cas ha abierto el camino para una nueva era en la agricultura, donde los debates sobre la ética y las regulaciones sobre el uso de esta tecnología determinarán su alcance en los años que están por venir.

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Recibido: 06-02-2018

Aceptado: 25-05-2018

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