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Artículo original
Biotecnología Vegetal Vol. 18, No. 3: 167 - 173, julio - septiembre, 2018
Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.
eISSN 2074-8647, RNPS: 2154
Remoción de nitrógeno en vinaza de caña de azúcar por cultivo heterotrófico de la cianobacteria filamentosa Geitlerinema sp.
Nitrogen removal from sugarcane vinasse by heterotrophic culture of filamentous cyanobacteria Geitlerinema sp.
Reinaldo Gaspar Bastos, Mauricio Daniel Montaño Saavedra, Jéssica Cristina Fonte, Isabely Fernanda Pizarro
Laboratorio de Microbiologia Aplicada e Controle (LABMAC), Universidade Federal de São Carlos (UFSCar). Rodovia Anhanguera, km 174 SP-330. Araras. São Paulo. Brasil. CEP 13600-970. e-mail: mauriciomontano2@gmail.com
RESUMEN
La vinaza es el principal efluente líquido del proceso de producción de etanol combustible a partir de caña de azúcar (Saccharum spp.). Debido a los grandes volúmenes generados, su tratamiento es uno de los mayores desafíos para el sector azucarero. Geitlerinema es una cianobacteria filamentosa con metabolismo heterotrófico, lo que hace posible su cultivo para tratar efluentes de elevada turbidez como la vinaza. El objetivo de este estudio fue determinar el potencial del cultivo heterotrófico de Geitlerinema sp. como método de tratamiento de vinaza de caña de azúcar. El cultivo se realizó en el efluente sin diluir, con adición de glucosa (10 g l-1). Se registraron los cambios en la concentración de biomasa, carbono orgánico y nitrógeno total. El porcentaje de lípidos y proteínas de la biomasa se determinó al final del experimento. La cianobacteria filamentosa no incrementó su biomasa durante 24 h de cultivo. Se observó remoción de carbono (35%) y nitrógeno (75%). La composición final de la biomasa en lípidos y proteínas fue de 15.0 y 14.6% (m/m), respectivamente. La remoción del 75% del nitrógeno total del medio de cultivo observado al final del experimento sugiere el potencial de la cianobacteria como opción para el tratamiento de la vinaza de caña de azúcar.
Palabras clave: destilería, efluente, glucosa, microalga, nutrientes
ABSTRACT
Vinasse is the main liquid effluent from the production process of fuel ethanol from sugarcane (Saccharum spp.). Due to the large volumes generated, its treatment is one of the biggest challenges for the sugar sector. Geitlerinema is a filamentous cyanobacterium with heterotrophic metabolism. For this reason is possible to culture it for treating high turbidity effluents, such as vinasse. The objective of this study was to determine the potential of the heterotrophic culture of Geitlerinema sp. as a treatment method for sugarcane vinasse. It was cultivated in the undiluted effluent, with the addition of glucose (10 g l-1). The changes in the concentration of biomass, organic carbon and total nitrogen were recorded. The percentage of lipids and proteins of the biomass was determined at the end of the experiment. The filamentous cyanobacteria did not increase its biomass during 24 h of culture. Carbon (35%) and nitrogen (75%) removal was observed. The final composition of the biomass in lipids and proteins was 15.0 and 14.6% (m / m), respectively. The removal of 75% of the total nitrogen from the culture medium observed at the end of the experiment suggests the potential of the cyanobacterium as an option for the treatment of sugarcane vinasse.
Keywords: distillery, effluent, glucose, microalgae, nutrients
INTRODUCCIÓN
Brasil es el mayor productor de caña de azúcar (Saccharum spp.) del mundo, y cubre el 40% del mercado global (FAO, 2014). Este cultivo es la materia prima para la elaboración de azúcar y etanol combustible. Este último es uno de los 10 productos más importantes para la economía brasileña (IBGE, 2015). Se estima que para la obtención de 1 litro de etanol combustible se generan entre 9 a 14 litros de vinaza (Silva et al., 2007), el principal efluente líquido de esta industria. Entre sus características fisicoquímicas más importantes se encuentran: pH ácido, color café oscuro, elevada turbidez y una alta concentración de materia orgánica y nutrientes (Carrilho et al., 2016). Tomando en cuenta que anualmente se producen cerca de 27.5 billones de litros de etanol combustible en Brasil (IBGE, 2015), el tratamiento de la vinaza es uno de los mayores desafíos para el sector sucroalcoholero en aras de disminuir el efecto ambiental negativo de este residual.
Entre las opciones para el tratamiento de este efluente se pueden encontrar la electrocoagulación (Khandegar y Saroha, 2012), digestión anaerobia (Moraes et al., 2015), procesos oxidativos avanzados (Thanapimmetha et al., 2017), cultivo de microorganismos (Bastos et al., 2015; Santana et al., 2017) y una combinación de los métodos anteriormente citados (Siles et al., 2011; Aziz et al., 2016; España-Gamboa et al., 2017). Se destaca el cultivo de microalgas y cianobacterias ya que su biomasa puede ser utilizada para la producción de biocombustibles y bioproductos de alto valor agregado (Brasil et al., 2017).
Estos microorganismos se cultivan generalmente bajo condiciones para el metabolismo fotoautotrófico, aprovechando su capacidad de realizar fotosíntesis (Faried et al., 2017). Sin embargo, debido a que la vinaza presenta una elevada turbidez, esta forma de cultivo solo es posible después de algún pretratamiento que clarifique el medio (Marques et al., 2013) o en el efluente diluido (Santana et al., 2017).
Se sabe que algunas cianobacterias pueden realizar el metabolismo heterotrófico y desarrollarse sin la necesidad de provisión de luz, pero con la exigencia de una fuente de carbono orgánico y oxígeno molecular (Pérez-García et al., 2011). Esta forma de cultivo posibilita, además, aumentar la concentración de biomasa en el proceso, la cual tiende a acumular mayor cantidad de lípidos, comparado con el cultivo fotoautotrófico, lo que es de especial interés para la posterior producción de biodiesel (Venkata Mohan et al., 2015).
Por otro lado, estudios consideran que entre el 20 y el 30% del costo de producción de biomasa de microalgas está asociado al proceso de separación o cosecha de estos microorganismos del medio de cultivo líquido (Barros et al., 2015), lo que puede reducir la factibilidad económica de todo el proceso productivo (Richardson et al., 2014). En este sentido, el cultivo de cianobacterias filamentosas puede facilitar esta operación debido a sus elevadas dimensiones (cerca de 200 µm) en comparación a aquellas microalgas y cianobacterias unicelulares (< 30 µm) (Markou y Georgakakis, 2011).
Entre las cianobacterias filamentosas se encuentran los géneros Anabaena, Anabaenopsis, Aphanizomenon, Nadularia, Oscilatoria, Spirulina, Phormidium, Nostoc, Nostochpsis y Scytonema, entre otros (Markou y Georgakakis, 2011). Sin embargo, hay pocas referencias en la literatura científica sobre el cultivo y tratamiento de efluentes con el empleo del género Geitlerinema (Sánchez-Alejandro y del Pilar, 2015), el cual está ampliamente distribuido en el territorio brasileño (Menezes y Bicudo, 2010). Atendiendo a lo anterior, el objetivo del presente estudio fue determinar el potencial del cultivo heterotrófico de la cianobacteria filamentosa Geitlerinema sp. como método para el tratamiento de vinaza de caña de azúcar.
MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación se llevó acabo en el Laboratorio de Microbiología Aplicada y Control del centro de Ciencias Agrarias de la Universidad Federal de São Carlos (UFSCar), localizado en la ciudad de Araras, en el estado de São Paulo, Brasil.
La vinaza usada en el estudio fue colectada de un ingenio sucroalcoholero de la ciudad de Araras, estado de São Paulo. Entre sus características físico-químicas se encontraban: color café oscuro, olor característico, pH 4.0, 3.72 g l-1 de carbono orgánico total (TOC), 0.29 g l-1 de nitrógeno total (TN), relación carbono/nitrógeno (C/N) de 12.8.
Se utilizó una cepa de Geitlerinema sp. gentilmente donada por el Instituto Botánico de São Paulo. La cianobacteria fue propagada autotróficamente en medio de cultivo estándar BG11 con pH 7.5 (Ripka et al., 1979) hasta una concentración celular aproximada de 1 g l-1, con aeración constante, a 25°C, fotoperiodo de 12 h: 12 h y radiación fotosintéticamente activa (PAR) de aproximadamente 45 µmol m-2 s-1.
El medio de cultivo para el experimento fue preparado con vinaza sin diluir y adición de glucosa (10 g de glucosa por litro de vinaza). Para la inoculación, un volumen suficiente de inóculo fue concentrado por centrifugación durante 20 minutos a 3 500 rpm y 15 °C. El sobrenadante fue descartado y el precipitado resuspendido en el medio de cultivo previamente esterilizado (autoclave a 121 °C por 20 minutos) y con pH corregido a 7.5 con adición de NaOH. El cultivo heterotrófico de la cianobacteria fue realizado con tres repeticiones, en agitador orbital (TE-420 TECNAL®, Brasil) a 25 °C en frascos Erlenmeyer® de 125 ml de capacidad cubiertos de la incidencia de la luz, que contenían 25 ml de medio de cultivo y 75 mg de biomasa (concentración inicial de biomasa en cada frasco de aproximadamente 3 g l-1).
En tiempo cero (medio de cultivo inoculado) y después de 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24 horas de cultivo se determinaron: la biomasa (g l-1) por filtración de un volumen conocido en membrana de 0.22 µm de poro y posterior secado a 105 °C hasta masa constante y la concentración de TOC y TN del medio de cultivo (g l-1) mediante analizador TOC (TOC-LCPN SHIMADZU®, Japón). Los resultados se presentaron como el valor medio de tres mediciones (n=3) y su respectiva desviación estándar. La relación C/N durante el cultivo fue calculada como la división del valor de TOC entre TN del medio de cultivo en cada intervalo de tiempo. Por último, al cabo de 24 horas de cultivo se cuantificó el contenido de lípidos y proteínas de la biomasa por los métodos propuestos por Bligh y Dyer (1959) y Dorsey et al. (1978), respectivamente, y se expresó como porcentaje másico respecto a la biomasa seca (%m/m).
Los análisis estadísticos fueron realizados utilizando el software R versión 3.4.0. Las medias fueron comparadas mediante análisis de variancia (ANOVA) y prueba de Tukey, para p<0.05, previa comprobación de los supuestos de normalidad de los datos y homogeneidad de varianzas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La curva de crecimiento de la cianobacteria filamentosa Geitlerinema sp. en vinaza de caña de azúcar sin diluir y con adición de glucosa, durante 24 horas de cultivo expresada como logaritmo natural de la relación entre la biomasa a cada tiempo de cultivo (x) y la biomasa inicial (xo=2.89±0.03 g l-1), no mostró una clara diferencia entre las fases típicas de cultivo (latencia, crecimiento exponencial y estacionaria) (Figura 1). Sin embargo, pudo observarse mantenimiento de la biomasa en valores próximos al valor inicial por lo menos en las 12 primeras horas de cultivo. A partir de ese periodo se observó un decrecimiento de la biomasa. Después de 24 horas de cultivo alcanzó 2.64±0.23 g l-1, sin diferencias significativas con la biomasa inicial (p=0.13). Este resultado sugirió que la cianobacteria se encontraba todavía en fase de adaptación después de ese periodo de tiempo.
En un estudio similar, Mattos y Bastos (2015) cultivaron la microalga unicelular Desmodesmus sp. en condición heterotrófica en vinaza de caña de azúcar sin diluir. Los autores informaron una fase de adaptación inicial del microrganismo de 9 horas y posterior crecimiento exponencial hasta llegar a 3.7 g l-1 en 24 horas (µmax=0.15 h-1). Las cianobacterias filamentosas generalmente presentan una fase de adaptación mayor a las unicelulares, más aún en el cultivo heterotrófico (Chojnacka y Noworyta, 2004; Yu et al., 2009; Trabelsi et al., 2013). Por tanto, la adaptación de Geitlerinema sp. en el medio de cultivo requeriría posiblemente más de 24 horas.
Marques et al. (2013) en el cultivo de la microalga C. vulgaris en vinaza diluida con agua residual urbana indicaron una disminución de la biomasa del inóculo de 10% en las primeras horas de cultivo, debido al estrés celular causado por la transferencia del microrganismo del medio de propagación estándar, al medio de cultivo con vinaza. En el presente estudio, la disminución máxima de biomasa ocurrió entre 15 a 21 horas de cultivo, y llegó a 17.2%. Una pre-adaptación del inóculo podría ser una alternativa para disminuir el estrés causado en esta fase del proceso.
Pudo observarse, además, un aumento en la concentración de carbono orgánico y nitrógeno en el medio de cultivo en las primeras horas del experimento. Este resultado posiblemente estuvo ocasionado por la lisis celular registrada entre 6 y 9 horas de cultivo o por la liberación de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) por parte de la cianobacteria como respuesta al estrés osmótico (Candido y Lombardi, 2018) o al estrés ocasionado por el cambio de las condiciones de cultivo (Trabelsi et al., 2013). Además, se sabe que la producción de estas substancias es estimulada por la adición de glucosa al medio de cultivo (Ding et al., 2013).
El cultivo de microalgas y cianobacterias es una alternativa promisora para la remoción de nutrientes de las aguas residuales agroindustriales (Venkata Mohan et al., 2015). En este estudio, al cabo de 24 horas de cultivo de la cianobacteria en vinaza sin diluir con la adición de glucosa, se observó remoción de carbono y nitrógeno hasta llegar al 35 y 75%, respectivamente (Figura 2). Este resultado fue mayor al 52% de remoción de nitrógeno informado por Mattos y Bastos (2015). Sin embargo, dichos autores no adicionaron glucosa al efluente. Tal resultado sugiere el potencial de Geitlerinema sp. para el tratamiento de efluentes (remoción de nitrógeno).
Tomando en cuenta que no se registró aumento de biomasa con el incremento del tiempo de cultivo, la remoción de carbono orgánico podría ser atribuida al consumo de la cianobacteria para obtener energía para el mantenimiento celular. En este sentido, glucosa y compuestos orgánicos presentes en la vinaza serian usados como fuente de carbono y consumidos en la respiración celular, liberando CO2(g) al ambiente (Pérez-García et al., 2011). Por otro lado, el consumo de nitrógeno puede estar relacionado con la síntesis de proteínas y nuevas enzimas como respuesta al cambio en las condiciones de cultivo (autotrófico en la propagación del inóculo, heterotrófico en el cultivo en vinaza) y en la fuente de nutrientes (CO2 y nitrato en la propagación del inóculo, moléculas orgánicas en el cultivo en vinaza) (Parnaudeau et al., 2008; Pérez-García et al., 2011). Otra hipótesis sobre la remoción de nitrógeno puede ser la volatilización de amoniaco del medio favorecida por el intercambio de gases en la respiración celular (O2, CO2) y la alcalinización del medio de cultivo (Markou et al., 2014), considerando que el cultivo de la cianobacteria presentó un pH final de 8.6 al cabo de las 24 horas de experimento.
La caracterización de la biomasa al final del cultivo indicó un contenido de lípidos y proteínas de 15.0 y 14.6% (m/m), respectivamente. Porcentajes diferentes a los indicados por Sánchez-Alejandro y del Pilar (2015) en el cultivo autotrófico de Geitlerinema lemmermannii en medio de cultivo 2F Guillard (5-7% de lípidos y 5-30% de proteínas). La acumulación de lípidos en lugar de proteínas puede ser atribuida, por un lado, a las diferentes condiciones de cultivo, ya que en general los cultivos heterotróficos tienden a favorecer la síntesis y acumulación de lípidos (Venkata et al., 2015). Por otro lado, se sabe que la limitación de nitrógeno está vinculada a la acumulación de lípidos (Markou et al., 2014), por lo que la relación C/N de 65 alcanzada en las últimas horas de experimento (Figura 2) indicaría una limitación de este nutriente en el cultivo.
Los resultados del presente estudio sientan las bases para el uso de Geitlerinema sp. en el tratamiento de residuales. Se requieren otras investigaciones para optimizar el cultivo de esta cianobacteria en vinaza, tomando en cuenta que su morfología filamentosa puede facilitar el proceso de separación de la biomasa y el medio de cultivo, característica importante para viabilizar su cultivo a gran escala.
CONCLUSIONES
Geitlerinema sp. posee potencial de para la remoción de carbono y nitrógeno en el tratamiento de vinazas de caña de azúcar.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la CAPES, CNPq y BNDES/FUNTEC por el apoyo económico al grupo de investigación en este estudio.
Conflictos de interés
Los autores no declaran conflictos de intereses.
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Recibido: 09-04-2018
Aceptado: 20-06-2018
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