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Reseña
Biotecnología vegetal 1: 3-9, enero-abril 2001
Fisiología del cultivo in vitro
Maria Jesús Cañal*, Roberto Rodríguez, Belén Fernández, Ricardo Sánchez-Tames y Juan Pedro Majada. *Autor para correspondencia
Lab. Fisiología Vegetal, Dpto B.O.S., C/ Catedrático Rodrígo Uría s/n 33071, Universidad de Oviedo, España.
RESUMEN
En los procedimientos de cultivo descritos hasta la década de los ochenta, no se hace ninguna referencia al control ambiental en el desarrollo de las plantas in vitro. Sin embargo, las tasas de crecimiento, desarrollo y muchas de las características fisiológicas y morfológicas de las plantas formadas in vitro están influenciadas por el ambiente físico, químico y gaseoso de los recipientes. El incremento de conocimientos acerca del control ambiental del cultivo de tejidos en condiciones estériles, está provocando una evolución de las distintas técnicas empleadas en la micropropagación de plantas. El ambiente in vitro en recipientes con baja tasa de ventilación presenta unas tasas bajas de flujo de materia y energía, con mínimas variaciones de temperatura, elevada humedad relativa y grandes cambios diarios de la concentración de CO2 en el interior de los recipientes. El tipo de recipiente de cultivo (tamaño, forma, material y sistema de cierre) puede condicionar la evolución de la composición gaseosa en su interior durante el período de cultivo. Ante los distintos factores de estrés que tienen que soportar durante las fases de la micropropagación las plantas producidas en recipientes con nulo o escaso intercambio gaseoso, pueden manifestar alteraciones o déficit en cuanto a su estructura anatómica, morfológica y fisiológica. Como consecuencia, estas plantas presentan un fenotipo incapaz de sobrevivir al transplante directo al invernadero o campo. Actualmente se pueden utilizar diferentes métodos para controlar el ambiente en las distintas fases de la micropropagación, ya sean cultivos heterótrofos, mixótrofos o autótrofos. La elección de la mejor estrategia va a depender de varios factores, destacando la especie, el número de transplantes requerido y la relación calidad precio entre otros.
Palabras clave: ambiente in vitro, características fisiológicas, control ambiental, cultivo de tejidos, micropropagación
ABSTRACT
The culture procedures described up to the eighties, did not made any mention to the environmental control of in vitro plant development. However, growth rate, development and many of the physiologic-morphologic features of the in vitro grown plants are influenced by the culture vessel. The increasing knowledge about the environmental control of culture vessels under sterile conditions, is helping to change micorpropagation procedures. The in vitro environment with lower rate ventilation, brings about low flow rates of matter and energy, with minimum variations of temperature, high relative humidity and large daily changes of the concentration of CO2 inside the culture vessel. The type of culture vessel (size, shape, fabric and closing system) can influence the evolution of the atmosphere along the time of culture. Although submitted to different stresses factors plant can be grown in vitro, but plants can be faulty in their anatomy, morphology and physiology. As a consequence, these plants shown a phenotype unable to survive to ex vitro conditions. Different strategies can be used to control the atmosphere along the different phases of micropropagation, in heterotrophic, mixotrophic or autotrophic cultures. The election of the best strategy will be based on different factors as species, number of transplantes required, or quality-price relationship.
enviromental control, tissue culture, micropropagation
Keywords: in vitro enviromental, characteristic physiology,
INTRODUCCIÓN
La micropropagación es una técnica, desarrollada para la producción en masa de plantas, que ha sido utilizada con éxito desde los años 60. La principal ventaja de esta técnica estriba en la multiplicación rápida de material clonal libre de enfermedades. Esta característica ha servido para introducir rápidamente en el mercado nuevas variedades de plantas obtenidas mediante selección, mutación, programas de mejora o manipulación genética. Sin embargo, la industria de la micropropagación presenta serias limitaciones debido a los elevados costes de producción, reduciéndose la mayor parte de su actividad al sector de plantas ornamentales (Holdgate y Zandvoort, 1992).
En la mayor parte de los procedimientos empleados actualmente no se hace referencia al control efectivo del desarrollo de las plantas in vitro. Sin embargo, las tasas de crecimiento, desarrollo y muchas de las características fisiológicas y morfológicas de las plantas formadas in vitro están influenciadas por el ambiente físico, químico y gaseoso de los recipientes (Kozai et al., 1992a; Buddenford-Joosten y Woltering, 1994). Por tanto el estudio y control del ambiente de los cultivos también incidirá positivamamente en la optimización de los procedimientos de micropropagación.
Características del ambiente in vitro en la micropropagación convencional
Tradicionalmente los protocolos de propagación han ignorado los factores ambientales del cultivo, centrándose en experimentos factoriales de aplicación exógena de nutrientes y reguladores del crecimiento. En estas condiciones las plantas se desarrollan en condiciones asépticas dentro de un recipiente hermético, expuestas a bajos niveles de luz, sobre un medio gelificado que contiene nutrientes para mantener un crecimiento heterótrofo, y todo ello bajo unas condiciones de elevada humedad relativa.
Los factores que pueden afectar al crecimiento y morfogénesis de las plantas in vitro se pueden clasificar como se indica en la figura 1. Los fenómenos que controlan los cambios ambientales en el interior de un recipiente de cultivo son similares a los que ocurren en el interior de un invernadero, ya que de hecho un recipiente de cultivo es, hasta cierto punto, un invernadero en miniatura mantenido en condiciones asépticas. Bajo este punto de vista, Kozai et al. (1992a) mantienen que es interesante realizar estudios ecológicos, ecofisiológicos y de fisiología e ingeniería ambiental en el proceso de micropropagación. Aunque el valor que presenta cada uno de los parámetros descritos en la figura 1, va a depender de las condiciones de la cámara de crecimiento, del recipiente, de las condiciones de cultivo y de los propios explantos, el ambiente in vitro presenta unas características generales que se resumen en la (Tabla 1). Como se puede observar, el ambiente in vitro presenta unas tasas bajas de flujo y energía, debido a la existencia de un sistema semicerrado, con mínimas variaciones de temperatura, elevada humedad relativa y grandes cambios diarios de la concentración de CO2 en el interior de los recipientes.
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Características de ambiente aéreo en el interior de los recipientes
El tipo de recipiente de cultivo (tamaño, forma, material y sistema de cierre) puede condicionar la evolución de la composición gaseosa en su interior durante el cultivo. En recipientes de cultivo cerrados herméticamente se ha detectado una acumulación de gases (dióxido de carbono -CO2, etileno -C2H4-, etano, etanol y acetaldehído) que, además de influir o controlar el crecimiento, también pueden afectar a procesos de diferenciación y morfogénesis (Thomas y Murashige, 1979; Righetti et al., 1990).
Para mantener un crecimiento heterótrofo en estos recipientes, es necesaria una fuente exógena de hidratos de carbono, ya que la concentración de CO2 durante el período luminoso está por debajo del punto de compensación (50-100 mmol. mol-1) (Ando, 1978; Fujiwara et al., 1987; Pospisilova et al., 1988; Desjardins et al., 1988; Infante et al., 1989; Kozai y Sekimoto, 1988). La concentración de CO2 aumenta de forma constante durante el período oscuro, aunque una vez reiniciado el período luminoso, el nivel de CO2 desciende rápidamente (Fujiwara et al., 1987; Fujiwara y Kozai, 1995). En estas condiciones, la falta de CO2 disminuye los requerimientos lumínicos de los cultivos, siendo más importante su papel en fotomorfogénesis que en fotosíntesis. Además, generalmente los gradientes de potencial hídrico y los coeficientes de difusión del aire y del medio en el recipiente son más pequeños que los existentes en el exterior, lo que genera bajas tasas de flujo de agua en el recipiente (Sallanon y Coudret, 1990). La introducción de filtros bacteriológicos en los recipientes de cultivo permite aumentar la tasa de intercambio gaseoso y mantener gradientes de humedad que han introducido nuevos parámetros a considerar en los procesos morfogénicos (Majada et al., 1997).
Característica del ambiente en los sustratos
Para estudiar la disponibilidad de agua, nutrientes y reguladores de desarrollo en los distintos sustratos empleados en el cultivo de tejidos, debemos de tener en cuenta los diferentes componentes del potencial hídrico (Debergh et al., 1981, Debergh, 1983) y otros tres factores de especial relevancia en sustratos gelificados: la dinánica de flujo, la velocidad de difusión de solutos y la influencia de la temperatura (Campbell y Cheftel, 1985).
A. Agar
Distintos autores han estudiado el efecto de la concentración y marca comercial de agar, así como el comportamiento de las distintas especies ante el tipo de agar y su concentración (Debergh, 1983; Bornman y Vogelmann, 1984; Kordan, 1988; Leshem, 1983 y Scherer, 1988), pero no se encontró una correlación entre las características y el crecimiento de las plantas.
B. Nutrientes y reguladores
La definición de protocolos para la micropropagación heterótrofa de plantas, se ha basado en experimentos factoriales de aplicación exógena de nutrientes y reguladores del crecimiento (Williams, 1992; Williams y Taji, 1991). Este hecho explica la gran cantidad de medios existentes, definidos específicamente para cada especie y tipo de explante empleado. Estos factores, junto al empleo de sustratos gelificados, han influido negativamente en la realización de trabajos que analicen el efecto del balance iónico y de la concentración total de iones y reguladores en la absorción y asimilación de nutrientes (George y Sherrington, 1984).
Aunque los medios nutritivos empleados en la micropropagación convencional han sido optimizados para cultivos heterótrofos, en la actualidad se trabaja para definir nuevas formulaciones adaptadas a las posibilidades de control ambiental existentes en la actualidad, investigando previamente el control y la eficiencia de la absorción de nutrientes bajo distintas condiciones ambientales (Kozai et al., 1992a). Resultados obtenidos en nuestro laboratorio ponen de manifiesto que el consumo de nutrientes es muy inferior al esperado, siendo únicamente significativo en el caso del fosfato, que puede llegar a ser limitante en algunos cultivos (Dantas et al., 1999 y Moncaleán et al., 1999). A partir del análisis de nuestros resultados y de los obtenidos por otros autores (Williams, 1992 y Leifert et al., 1995) parece claro que la composición y la concentración mineral de los medios de cultivo, así como el ambiente del cultivo condiciona totalmente la respuesta de los cultivos en cuanto a crecimiento y características fisiológicas de las plantas obtenidas; lo cual está condicionando la definición de nuevos medios de cultivo aplicados de forma estática o de forma dinámica durante el transcurso de cada período de cultivo.
Al igual que en el medio mineral, de forma general los protocolos de aplicación de reguladores del crecimiento se establecen mediante ensayos factoriales, manteniendo los cultivos en contacto con la hormona durante todo el subcultivo. Sin embargo, resultados obtenidos en nuestro laboratorio ponen de manifiesto que la absorción de hormonas en la fase de proliferación se produce mayoritariamente en las primeras horas de cultivo (Feito et al., 1994; Feito et al., 1995; Moncaleán et al., 1999), absorción que condiciona totalmente la respuesta morfogénica de los cultivos mediante la alteración del balance endógeno de reguladores del crecimiento (Dantas et al., 1997). En este sentido ensayos realizados en nuestro laboratorio, ponen de manifiesto que la administración de pulsos hormonales durante períodos cortos es más efectiva en la proliferación de yemas axilares y lo que resulta más interesante, favorece el posterior enraizamiento de los tallos obtenidos.
Respuestas de tallos/plántulas al ambiente in vitro
En la tabla 2 se resumen algunas de las respuestas más habituales de los explantos introducidos en cultivo, como resultado de la interacción que se produce entre los explantos y las características ambientales descritas. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio han demostrado que la manipulación del ambiente en los recipientes de cultivo, modula las características morfo-anatómicas y fisiológicas de las plantas obtenidas a través de cultivo de tejidos (Majada et al., 1998, Majada et al., 1999). De forma general podríamos decir que el fenotipo inducido por las condiciones de cultivo es intermedio entre plantas crecidas en ambientes herméticos no controlados y plantas aclimatadas.
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Estrategias en el control ambiental de los recipientes
Como consecuencia del ambiente in vitro, todos los factores descritos en la tabla 2, contribuyen al desarrollo de plantas con un fenotipo incapaz de sobrevivir al transplante a invernadero o campo (Preece y Sutter, 1991), debido al estrés hídrico provocado por la ausencia de regulación estomática (Brainerd y Fuchigami, 1982; Conner y Conner, 1984; Ziv et al., 1987; Pospisilova et al., 1988) y menor cantidad de ceras epicuticulares (Sutter y Langhams, 1979, 1982; Sutter, 1988; Conner y Conner, 1984).
Actualmente disponemos de distintas estrategias para controlar el ambiente en los sistemas de micropropagación: control en cultivos heterótrofos (a), en cultivos mixótrofos (b) y en cultivos autótrofos (c).
a. El control del ambiente en cultivos heterótrofos (recipientes sin ventilación) se centra en las fases de enraizamiento y aclimatación. El ambiente puede ser modificado gradualmente en estas etapas para favorecer posteriormente el crecimiento y desarrollo de tallos y plantas en invernadero. Aunque ampliamente utilizada por los micropropagadores convencionales, las posibilidades de control son mínimas y se limita generalmente a una disminución de la humedad relativa.
b. Establecimiento de cadenas cicloclonales de micropropagación mixótrofa, las cuales se sustentan en una mezcla de nutrición heterótrofa y autótrofa (recipientes con ventilación), y que va a depender de la disponibilidad de CO2 y azúcares por los explantos en el recipiente de cultivo.
c. La tercera estrategia alternativa la constituye el control del ambiente para mantener un crecimiento autótrofo (recipientes con ventilación y control de dióxido de carbono) aséptico en las fases de multiplicación y enraizamiento.
La elección de la mejor estrategia va a depender de los objetivos específicos de producción, así como de los requerimientos culturales de cada especie, número de transplantes requerido, valor añadido del producto, relación calidad precio, etc.
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