INTRODUCCIÓN

La soya Glycine max (L.) Merrill, es uno de los cultivos de mayor importancia económica a nivel mundial, debido a su alto contenido de aceite y proteínas en sus semillas; considerada de gran valor para la industria y la alimentación tanto humana como animal (Hada et al., 2018).

No obstante, el crecimiento y la productividad de este cultivo son afectados por estreses bióticos y abióticos. Esto ha requerido el desarrollo de programas de mejora genética para obtener variedades mejoradas, pero su eficiencia está limitada debido a la estrecha base genética de este cultivo. En la actualidad se emplea la Ingeniería Genética para transferir genes entre organismos no emparentados en cortos periodos de tiempo, lo que resulta una ventaja sobre los métodos convencionales de mejoramiento genético en el cultivo de la soya (Mangena et al., 2017; RNBA, 2020).

En esta especie tanto la regeneración de plantas como la transformación genética, es genotipo dependiente. En el cultivar cubano Incasoy-27 se ha desarrollado la embriogénesis somática en cotiledones cigóticos inmaduros (Pérez et al., 2012; Pérez et al., 2017; Pérez et al., 2019). Así mismo, se desarrolló un protocolo de transformación genética por A. tumefaciens (Pérez, 2016).

Existen antecedentes del empleo de embriones somáticos en la transformación genética vía biobalística (Tougou et al., 2009), y Agrobacterium tumefaciens (Wiebke-Strohm et al., 2011). Pero a pesar de los esfuerzos realizados por mejorar la eficiencia de transformación con A. tumefaciens, esta se mantiene baja debido a la dependencia del genotipo en términos de susceptibilidad a la infección, así como, la baja capacidad de regeneración de plantas a partir de embriones somáticos transformados genéticamente (Kumari et al., 2016).

Además, la transferencia de genes no siempre es estable, debido a la baja eficiencia y aleatoriedad en la integración del ADN-T en el genoma del hospedero, siendo necesario un gen capaz de expresar una proteína que permita la selección de los tejidos transformados (Tougou et al., 2009). Entre estos se encuentra el gen bar que confiere resistencia a los herbicidas que tienen como ingrediente activo la fosfinotricina (Rao et al., 2009 ).

Sin embargo, en el género Glycine existen pocos trabajos que describen la utilización del glufosinato de amonio para la selección de embriones somáticos y plantas transformadas (Rao et al., 2009; Pareddy et al., 2020). Por otra parte, en la literatura científica consultada no existe referencia al uso de este compuesto para la evaluación de la expresión estable del gen bar en este cultivo.

El cultivar ‘Incasoy 27’ obtenido en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas de Cuba (INCA) por la vía de la hibridación natural de la variedad brasileña BR-32 en condiciones de campo (Ponce et al., 2003), ha sido propagado por embriogénesis somática y se han estudiado diferentes factores que pueden incidir en su transformación genética (Pérez et al., 2012; Pérez et al., 2014; Pérez et al., 2015; Pérez et al., 2017; Pérez et al., 2019). Sin embargo, se requiere establecer un método que permita la selección in vitro de las plantas regeneradas.

Este trabajo tuvo como objetivo seleccionar in vitro líneas transgénicas de soya cultivar Incasoy-27 obtenidas de embriones somáticos transformados con Agrobacterium tumefaciens.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Embriones somáticos de soya cultivar Incasoy-27 en etapa globular obtenidos según Pérez et al. (2012).

Cepa bacteriana y plasmidio

Se empleó la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens (Hood et al., 1993) que porta el plasmidio pCAMBIA3301 (CAMBIA, Australia), que contiene los genes bar (Thompson et al., 1987) y uidA (Jefferson, 1987).

El gen bar de Streptomyces hygroscopicus codifica para la enzima fosfinotricina N-acetil transferasa, que confiere resistencia a los herbicidas que contengan fosfinotricina como producto activo. Este gen está regulado por el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) y el terminador 35S poliadenilado del mismo virus. El gen uidA contiene un intrón y codifica para la β-glucuronidasa (GUS); es regulado por el mismo promotor que el gen bar y por la secuencia terminadora (Tnos) poliadenilada de la enzima neopalina sintetasa de A. tumefaciens (Figura 1).

[Figure ID: f1] Figura 1..

Esquema de la región ADN-T del plasmidio pCAMBIA3301.

Cocultivo

Los embriones somáticos fueron sumergidos en 5.0 ml de una suspensión de Agrobacterium tumefaciens (DO_600nm=0.4) e incubados durante 20 minutos en agitación a 25.0 rpm a 26±1.0 °C en condiciones de oscuridad. Posteriormente, para eliminar el exceso de la bacteria se colocaron 10 segundos, sobre papel de filtro (Whatman^® 125 mm) estéril en cabina de flujo laminar según lo referido por Wiebke-Strohm et al. (2011) .

El cocoultivo se realizó en placas de Petri que contenían medio de cultivo de multiplicación con las sales minerales de Murashige y Skoog (1962) (MS), vitaminas B5 (Gamborg et al., 1968), 2,4-D 20 mg l^-1, sacarosa 3.0%, acetosiringona (AS) 200 µM, cisteína 100 mg l^-1, ácido cítrico 50.0 mg l^-1, pH 5.5 y Gelrite^® 0.3%, en condiciones de oscuridad durante cuatro días.

Selección de embriones somáticos y plantas in vitro de soya con resistencia a fosfinotricina.

Al finalizar el periodo de cocultivo, los embriones somáticos se lavaron con agua desionizada estéril y timentina (Duchefa, Holanda) 200 mg l^-1, hasta eliminar los restos de bacteria. La timentina se esterilizó por filtración, y se adicionó después de la esterilización por autoclave del medio de cultivo.

Luego los embriones somáticos fueron secados por contacto con papel de filtro estéril, y colocados en placas de Petri que contenían medio de cultivo de multiplicación. Además, se adicionó la timentina y el agente selectivo fosfinotricina (6.0 mg l^-1), según lo referido por Pérez et al. (2015).

Los embriones somáticos que lograron sobrevivir a la selección con el herbicida, fueron colocados en medio de cultivo de maduración durante 28 días de cultivo. Luego los embriones somáticos maduros fueron desecados parcialmente durante cuatro días, y transferidos a medio de cultivo de germinación durante 30 días (Pérez et al., 2017).

A partir de las líneas de plantas supuestamente transformadas y no transformadas (controles), se tomaron hojas sin síntomas que fueron colocadas en placa de Petri que contenían 20 ml de una mezcla de Gelrite^® 0.3% en agua desionizada estéril a pH 5.8; en cabina de flujo laminar, se añadieron diferentes concentraciones de fosfinotricina (2.0, 4.0, 6.0 mg l^-1), excepto en el tratamiento control sin el agente selectivo. Todo el proceso de crecimiento y desarrollo se realizó en cámara de crecimiento con luz solar con 12-13 horas de luz e intensidad del flujo de fotones fotosintéticos de 68.0-72.0 μmol m^-2 s^-1 a 26±1.0 °C.

A los siete días se determinó mediante observación visual el cambio en el color de las hojas y de esta manera se constató si las líneas de plantas regeneradas mostraban o no resistencia a la fosfinotricina.

Análisis histoquímico y molecular en líneas de plantas transformadas

Detección histoquímica

A partir del ensayo histoquímico GUS (Jefferson et al., 1987), se determinó la actividad transitoria del gen uidA. Muestras de posibles tejidos transformados y el control, se colocaron en tubos de 1.5 ml, enjuagadas con agua desionizada estéril y se secaron en una campana al vacío.

Después se añadió 1.0 ml de acetona al 90.0% (v/v) y se colocaron 15 minutos en hielo (aprox. 4.0 °C). Se lavaron tres veces con una solución tampón de fosfato de sodio 0.1 M, se colocaron en tubos con la solución de X-Gluc (Jefferson et al., 1987) y luego en una cámara de infiltración (Bioblock, Inglaterra) con una bomba de vacío (Thomas^®, EUA) 15 minutos a una presión de 84 659.7 pascales (Pa), seguido de una represurización. Finalmente se incubaron 24 horas a 37.0±1.0 °C en la oscuridad. Al concluir se lavaron con la solución tampón y se colocaron en etanol 70% (v/v).

La solución con la sal de ciclohexilamonio del ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucuronídeo (X-Gluc), se preparó con el tampón fosfato de sodio (Na₃PO₄, pH 7.0) 100 mM, EDTA 10 mM, ferrocianuro de potasio K₄Fe(CN)₆ 0.1 M, ferricianuro de potasio K₃Fe(CN)₆ 0.1 M, sustrato X-Gluc 100 mM (Duchefa, Holanda), dimetil sulfóxido 1.5% y Tritón ^® X-100 1.0% (v/v). La expresión transitoria del gen uidA se determinó mediante evaluación visual al microscopio óptico.

Análisis molecular mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Para confirmar la transformación genética de las líneas de plantas in vitro regeneradas, se realizó la extracción del ADN genómico, según el procedimiento de Rojas et al. (2014). Los fragmentos de hojas (0.3 cm²) de plantas transformadas y no transformadas se sumergieron en 50 μl de la solución tampón A (100 mM NaOH; 2.0% Tween-20) y se incubaron a 95 °C, diez minutos. Se añadió 50 μl de la solución tampón B (150 mM Tris-HCl pH 2.0; 2.0 mM EDTA), y se mezclaron moderadamente hasta homogenizar los tampones.

La reacción de amplificación se realizó en un volumen total de 20 μl que contenía 2.0 μl de una mezcla con el ADN genómico, 200 μM dNTPs, 0.4 μM de cada cebador (directo y reverso), 1.0 U de la enzima polimerasa Dream Taq (5 U μl^-1) (Fermentas, Alemania), 1.0% BSA (m/v), 1.0% PVP 44 000 (m/v) y 1x del tampón Green Buffer. Como control positivo se utilizó 1.0 μl del plasmidio pCAMBIA3301, control negativo ADN genómico de plantas sin transformar y un marcador molecular GeneRuler™ DNA Ladder Mix (Fermentas, Alemania). Para amplificar los fragmentos de los genes bar y uidA, se usaron cebadores con las secuencias (Tabla 1).

Tabla 1..

Cebadores utilizados en la detección por PCR de los genes bar y uidA.

El PCR se realizó en el termociclador Mastercycler (Eppendorf^®, Alemania). El programa para amplificar el gen bar, comenzó con cuatro minutos de desnaturalización a 95 °C, 35 ciclos de amplificación, 45 segundos a 95 °C, un minuto a 65 °C de hibridación, un minuto a 72 °C de extensión. Al concluir se añadió un paso final de extensión a 72 °C por 10 minutos. Para el fragmento del gen uidA, se siguió una secuencia similar excepto la temperatura de hibridación a 68 °C.

Los fragmentos amplificados se corrieron mediante electroforesis a 100 Volt, durante 45 minutos en gel de agarosa 1.5% (m/v) en el tampón de corrida TBE 1x (100 mM Tris-HCl, 83.0 mM ácido bórico, 1.0 mM EDTA, pH=8.0).

El gel se tiñó en una solución de bromuro de etidio a 0.5 μg ml^-1 (Green y Sambrook, 2012) y fue visualizado en un transiluminador de luz ultravioleta (MacroVue, Alemania).

La eficiencia de transformación genética expresada en porciento (%), se determinó a partir del número de plantas regeneradas que mostraron resistencia a la fosfinotricina y positivas al PCR, entre el número de embriones somáticos inoculados.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Con el empleo de la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens fue posible la transformación genética de embriones somáticos de soya cultivar cubano Incasoy-27, lo que se demostró mediante procedimientos histoquímicos y moleculares.

Las plantas in vitro obtenidas a partir de embriones somáticos no transformados, mantuvieron las características morfológicas típicas de la especie (Figura 2 A). Sin embargo, las regeneradas a partir de embriones somáticos que mostraron resistencia a la fosfinotricina 6.0 mg l^-1, se caracterizaron por tener un crecimiento más lento con respecto a los controles in vitro no transformados y los embriones tuvieron una germinación completa (Figura 2 C, D, E).

Después de siete días las hojas sin tratar con fosfinotricina mantuvieron el color verde excepto en los bordes donde se realizaron los cortes. Sin embargo, cuando los fragmentos de hojas fueron colocados en diferentes concentraciones de fosfinotricina, se encontró que existía clorosis en las hojas debido al efecto tóxico del herbicida, y causó la muerte en la totalidad del tejido en la mayor concentración evaluada (Figura 2 F). Por el contrario, en las hojas de las líneas regeneradas no se encontraron daños visibles de toxicidad por el herbicida (Figura 2 G).

[Figure ID: f2] Figura 2..

Selección in vitro de plantas regeneradas a partir de embriones somáticos supuestamente transformados de Glycine max cultivar Incasoy-27. (A) Planta no transformada. (B) Multiplicación de embriones somáticos en medio de cultivo de selección con 6.0 mg l^-1 de fosfinotricina. (C, D, E) Líneas de plantas regeneradas supuestamente transformadas. (F) Ensayo in vitro con fragmentos de hojas de plantas no transformadas en medio de cultivo agar-agua y diferentes concentraciones de fosfinotricina. (G) Selección in vitro de líneas regeneradas en medio de cultivo agar-agua y fosfinotricina 6.0 mg l^-1 a los siete días. (1, 2) Líneas con resistencia a fosfinotricina, (c) controles no transformados. Barra= 1.0 cm

El retardo en el crecimiento en las líneas regeneradas pudo estar dado por el efecto del estrés que se produce por la interacción del tejido vegetal con la bacteria durante la infección y regeneración de plantas. En este sentido, Olhoft et al. (2003) plantearon que el empleo de la fosfinotricina (1.33 a 5.0 mg l^-1) pero en nudo cotiledonal, inhibió la elongación de la mayoría de los brotes transformados en la variedad Bert. Según estos autores con este agente selectivo, la elongación de los brotes ocurrió entre 6 y 12 meses después del cocultivo, mientras que con higromicina requerían de 2 a 6 meses.

Al colocar las hojas de las plantas en el medio de cultivo de selección con la fosfinotricina, permitió diferenciar las plantas que mostraban resistencia de los controles no transformados. Un ensayo similar fue realizado por Dang y Wei (2007), pero con la diferencia que con ayuda de un pincel le aplicaron una solución de 200 mg l^-1 de fosfinotricina a las plantas. A los diez días realizaron la evaluación y encontraron un cambio de color en las hojas de las plantas control producto al efecto tóxico del herbicida, el cual no fue visible en las líneas de plantas transgénicas.

Posteriormente, se demostró, además, que las plantas obtenidas de embriones somáticos de soya cultivar Incasoy-27 posibles transformados, contenían los genes bar y uidA. Se encontró expresión estable del gen uidA, aunque con diferencias en la intensidad de la expresión GUS, lo cual no fue encontrado en las plantas controles. En la línea uno, se evidenció una mayor actividad GUS en toda la superficie de la hoja; mientras que en la línea dos, fue menos intensa con manchas aisladas en ambos meristemos de la hoja. Desafortunadamente no pudo ser evaluada la expresión GUS en la línea tres (Figura 3).

[Figure ID: f3] Figura 3..

Expresión estable del gen uidA en hojas de plantas in vitro de Glycine max cultivar Incasoy-27. (A) Control negativo; (B) Línea 1; (C) Línea 2. Barra= 0.5 cm.

En el presente experimento, el empleo del gen uidA con el promotor constitutivo CaMV35S permitió demostrar que la tinción GUS fue debido a su expresión en el tejido vegetal y no por contaminación con Agrobacterium tumefaciens. Esto fue confirmado mediante el análisis molecular de reacción en cadena de la polimerasa.

Los fragmentos amplificados contenían las bandas de 402 y 400 pb referentes a los genes bar y uidA en las líneas regeneradas uno y dos. Estas bandas fueron iguales a las encontradas en el control positivo referido al plasmidio (pCAMBIA3301) y no se encontraron en los controles de plantas no transformadas, lo que indica que no hubo contaminación en el proceso de manipulación del ADN genómico. En un análisis posterior en la línea tres se encontró la banda referente al gen uidA y no fue visible la banda del gen bar (Figura 4).

[Figure ID: f4] Figura 4..

Electroforesis con productos amplificados en plantas de Glycine max cultivar Incasoy-₂7. Amplificación de fragmentos del gen bar (A) y el gen uidA (B) en las líneas uno y dos. (C) Amplificación de fragmentos de 400 pb del gen uidA en las líneas uno y tres. Las flechas indican bandas de 500 pb. Leyenda: (1+, 2+, 3+) productos de PCR de muestras de ADN de las líneas transformadas, (N) control negativo de planta no transformada, (P) control positivo con ADN plasmídico de pCAMBIA3301; (H₂O) agua estéril control negativo, (M) marcador molecular.

Los investigadores De Bondt et al. (1994), hicieron referencia a que la expresión transitoria depende de la adquisición del ADN-T, mientras que la expresión estable, depende de la integración funcional del ADN-T en el genoma del hospedero. Según este planteamiento, los resultados obtenidos demuestran que el gen bar, fue transferido e integrado de manera funcional en el genoma de las líneas regeneradas, siendo posible obtener plantas transgénicas vía Agrobacterium tumefaciens a partir de embriones somáticos de soya cultivar Incasoy-27. La baja eficiencia alcanzada en la transformación genética del cultivar cubano de soya ‘Incasoy-27’ (Tabla 2), se corresponde con lo descrito en la literatura científica, tanto para la transformación genética de cotiledones y embriones somáticos vía A. tumefaciens, y con el uso de la biobalística en embriones somáticos (Mariashibu et al., 2013).

Tabla 2..

Eficiencia en la transformación genética de plantas mediada por Agrobacterium tumefaciens en soya cultivar Incasoy-27.

Se plantea que un tiempo prolongado de cultivo de los embriones somáticos utilizados en la transformación genética, pudiera influir en la eficiencia de transformación genética y regeneración de plantas completas (Hazel et al., 1998).

En relación con esto, Wiebke-Strohm et al. (2011) evaluaron diferentes plasmidios en variedades brasileñas de soya, pero combinaron la biobalística con el A. tumefaciens, y obtuvieron un 2.0% de eficiencia de transformación a partir de 1 225 embriones somáticos en la variedad Bragg, 5.2% de 96 embriones somáticos en la variedad Vencedora, y 12.0% en la variedad IAS5 con empleo de 4 924 embriones somáticos transformados. En otros trabajos, pero con empleo de cotiledones inmaduros, Ko et al. (2003) encontraron en tres experimentos de transformación genética con A. tumefaciens cada uno con 225 a 267 cotiledones de la variedad Jack, entre tres y cuatro plantas por experimento, para una eficiencia de transformación entre 1.1 a 1.7%. Por ello, disponer de una metodología para obtener plantas genéticamente modificadas es un desafío en la mayoría de las variedades de soya, debido a diferencias en la respuesta en el cultivo in vitro, que junto a la incompatibilidad con las cepas de Agrobacterium tumefaciens y las diferencias en los procedimientos empleados, han resultado en una baja eficiencia de transformación.

CONCLUSIONES

A partir de embriones somáticos de soya cultivar Incasoy-27 transformados con Agrobacterium tumefaciens es posible seleccionar in vitro líneas transgénicas. Se demostró mediante análisis histoquímico y molecular, la integración y expresión de los genes uidA y bar en el genoma de las plantas transformadas con 0.30% de eficiencia. Los resultados de este trabajo se alcanzan por primera vez con este cultivar y cepa de Agrobacterium tumefaciens.