Artículo original

Biotecnología Vegetal Vol. 21, No. 1: 44 - 52, enero - marzo, 2021

Instituto de Biotecnología de las Plantas. UCLV. MES.

eISSN 2074-8647, RNPS: 2154

 

Selección in vitro de líneas transgénicas de soya obtenidas de embriones somáticos transformados con Agrobacterium tumefaciens

 

In vitro selection of transgenic soybean lines obtained from somatic embryos transformed with Agrobacterium tumefaciens

 

 

Jorge L. Pérez Pérez1,2* https://orcid.org/0000-0003-3372-7559

Lourdes R. García2 https://orcid.org/0000-0003-1016-6939

Novisel Veitía2 https://orcid.org/0000-0001-6357-4843

Luis E. Rojas2 https://orcid.org/0000-0002-0107-1842

 

1Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal, Universidad de Granma. Carretera a Manzanillo km 17,5 Peralejo. Bayamo. Granma. Cuba. CP 85100.

2Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54830.

*Autor para correspondencia e-mail: jperez@udg.co.cu

 

 

RESUMEN

Aunque la transformación genética en Glycine max ha sido intensamente investigada, el proceso sigue siendo ineficaz. En el presente trabajo se aborda por primera vez la selección in vitro de líneas transgénicas de soya cultivar Incasoy-27. A partir de embriones somáticos transformados con Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105, se logró la regeneración de tres líneas de plantas supuestamente transformadas que mostraron resistencia a la fosfinotricina 6.0 mg l-1. El análisis histoquímico GUS demostró expresión estable del gen uid A en hojas de dos líneas de plantas. Posteriormente se confirmó con la reacción en cadena de polimerasa, la presencia de los genes bar y uidA en dos líneas regeneradas; mientras que en la tercera línea se encontró la banda referente al gen uidA pero no fue posible demostrar la presencia del gen bar. En conclusión, es posible la selección in vitro de líneas transgénicas de soya cultivar Incasoy-27, con expresión de los genes uidA y bar en el genoma de las plantas transformadas y 0.30% de eficiencia.

Palabras clave: gen bar, Glycine max, glufosinato, transformación genética

ABSTRACT

Although genetic transformation in Glycine max has been intensively investigated, the process remains ineffective. In the present work, for the first time, the in vitro selection of transgenic lines of soybean variety Incasoy-27 is addressed. From somatic embryos transformed with Agrobacterium tumefaciens strain EHA105, the regeneration of three lines of supposedly transformed plants that showed resistance to phosphinothricin 6.0 mg l-1 was achieved. GUS histochemical analysis demonstrated stable expression of the uidA gene in leaves of two plant lines. Subsequently, the presence of the bar and uidA genes in two regenerated lines was confirmed with the polymerase chain reaction; while in the third line the band referring to the uidA gene was found but it was not possible to demonstrate the presence of the bar gene. In conclusion, is possible to in vitro select transgenic lines of soybean variety Incasoy-27, with expression of the uidA and bar genes in the genome of the transformed plants and 0.30% efficiency.

Keywords: bar gene, Glycine max, glufosinate, genetic transformation

 

 

INTRODUCCIÓN

La soya Glycine max (L.) Merrill, es uno de los cultivos de mayor importancia económica a nivel mundial, debido a su alto contenido de aceite y proteínas en sus semillas; considerada de gran valor para la industria y la alimentación tanto humana como animal (Hada et al., 2018).

No obstante, el crecimiento y la productividad de este cultivo son afectados por estreses bióticos y abióticos. Esto ha requerido el desarrollo de programas de mejora genética para obtener variedades mejoradas, pero su eficiencia está limitada debido a la estrecha base genética de este cultivo. En la actualidad se emplea la Ingeniería Genética para transferir genes entre organismos no emparentados en cortos periodos de tiempo, lo que resulta una ventaja sobre los métodos convencionales de mejoramiento genético en el cultivo de la soya (Mangena et al., 2017; RNBA, 2020).

En esta especie tanto la regeneración de plantas como la transformación genética, es genotipo dependiente. En el cultivar cubano Incasoy-27 se ha desarrollado la embriogénesis somática en cotiledones cigóticos inmaduros (Pérez et al., 2012; Pérez et al., 2017; Pérez et al., 2019). Así mismo, se desarrolló un protocolo de transformación genética por A. tumefaciens (Pérez, 2016).

Existen antecedentes del empleo de embriones somáticos en la transformación genética vía biobalística (Tougou et al., 2009), y Agrobacterium tumefaciens (Wiebke-Strohmet al., 2011). Pero a pesar de los esfuerzos realizados por mejorar la eficiencia de transformación con A. tumefaciens, esta se mantiene baja debido a la dependencia del genotipo en términos de susceptibilidad a la infección, así como, la baja capacidad de regeneración de plantas a partir de embriones somáticos transformados genéticamente (Kumari et al., 2016).

Además, la transferencia de genes no siempre es estable, debido a la baja eficiencia y aleatoriedad en la integración del ADN-T en el genoma del hospedero, siendo necesario un gen capaz de expresar una proteína que permita la selección de los tejidos transformados (Tougou et al., 2009). Entre estos se encuentra el gen bar que confiere resistencia a los herbicidas que tienen como ingrediente activo la fosfinotricina (Rao et al., 2009 ).

Sin embargo, en el género Glycine existen pocos trabajos que describen la utilización del glufosinato de amonio para la selección de embriones somáticos y plantas transformadas (Rao et al., 2009; Pareddy et al., 2020). Por otra parte, en la literatura científica consultada no existe referencia al uso de este compuesto para la evaluación de la expresión estable del gen bar en este cultivo.

El cultivar ‘Incasoy 27’ obtenido en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas de Cuba (INCA) por la vía de la hibridación natural de la variedad brasileña BR-32 en condiciones de campo (Ponce et al., 2003), ha sido propagado por embriogénesis somática y se han estudiado diferentes factores que pueden incidir en su transformación genética (Pérez et al., 2012; Pérez et al., 2014; Pérez et al., 2015; Pérez et al., 2017; Pérez et al., 2019). Sin embargo, se requiere establecer un método que permita la selección in vitro de las plantas regeneradas.

Este trabajo tuvo como objetivo seleccionar in vitro líneas transgénicas de soya cultivar Incasoy-27 obtenidas de embriones somáticos transformados con Agrobacterium tumefaciens.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Embriones somáticos de soya cultivar Incasoy-27 en etapa globular obtenidos según Pérez et al. (2012).

Cepa bacteriana y plasmidio

Se empleó la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens (Hood et al., 1993) que porta el plasmidio pCAMBIA3301 (CAMBIA, Australia), que contiene los genes bar (Thompson et al., 1987) y uidA (Jefferson, 1987).

El gen bar de Streptomyces hygroscopicus codifica para la enzima fosfinotricina N-acetil transferasa, que confiere resistencia a los herbicidas que contengan fosfinotricina como producto activo. Este gen está regulado por el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) y el terminador 35S poliadenilado del mismo virus. El gen uidA contiene un intrón y codifica para la β-glucuronidasa (GUS); es regulado por el mismo promotor que el gen bar y por la secuencia terminadora (Tnos) poliadenilada de la enzima neopalina sintetasa de A. tumefaciens (Figura 1).

Figura 1. Esquema de la región ADN-T del plasmidio pCAMBIA3301.

Cocultivo

Los embriones somáticos fueron sumergidos en 5.0 ml de una suspensión de Agrobacterium tumefaciens (DO600nm=0.4) e incubados durante 20 minutos en agitación a 25.0 rpm a 26±1.0 °C en condiciones de oscuridad. Posteriormente, para eliminar el exceso de la bacteria se colocaron 10 segundos, sobre papel de filtro (Whatman ® 125 mm) estéril en cabina de flujo laminar según lo referido por Wiebke-Strohm et al. (2011).

El cocoultivo se realizó en placas de Petri que contenían medio de cultivo de multiplicación con las sales minerales de Murashige y Skoog (1962) (MS), vitaminas B5 (Gamborg et al., 1968), 2,4-D 20 mg l-1, sacarosa 3.0%, acetosiringona (AS) 200 µM, cisteína 100 mg l-1, ácido cítrico 50.0 mg l-1, pH 5.5 y Gelrite® 0.3%, en condiciones de oscuridad durante cuatro días.

Selección de embriones somáticos y plantas in vitro de soya con resistencia a fosfinotricina.

Al finalizar el periodo de cocultivo, los embriones somáticos se lavaron con agua desionizada estéril y timentina (Duchefa, Holanda) 200 mg l-1, hasta eliminar los restos de bacteria. La timentina se esterilizó por filtración, y se adicionó después de la esterilización por autoclave del medio de cultivo.

Luego los embriones somáticos fueron secados por contacto con papel de filtro estéril, y colocados en placas de Petri que contenían medio de cultivo de multiplicación. Además, se adicionó la timentina y el agente selectivo fosfinotricina (6.0 mg l-1), según lo referido por Pérez et al. (2015).

Los embriones somáticos que lograron sobrevivir a la selección con el herbicida, fueron colocados en medio de cultivo de maduración durante 28 días de cultivo. Luego los embriones somáticos maduros fueron desecados parcialmente durante cuatro días, y transferidos a medio de cultivo de germinación durante 30 días (Pérez et al., 2017).

A partir de las líneas de plantas supuestamente transformadas y no transformadas (controles), se tomaron hojas sin síntomas que fueron colocadas en placa de Petri que contenían 20 ml de una mezcla de Gelrite® 0.3% en agua desionizada estéril a pH 5.8. En cabina de flujo laminar, se añadieron diferentes concentraciones de fosfinotricina (2.0, 4.0, 6.0 mg l-1), excepto en el tratamiento control sin el agente selectivo. Todo el proceso de crecimiento y desarrollo se realizó en cámara de crecimiento con luz solar con 12-13 horas de luz e intensidad del flujo de fotones fotosintéticos de 68.0-72.0 μ mol m-2 s-1 a 26±1.0 °C.

A los siete días se determinó mediante observación visual el cambio en el color de las hojas y de esta manera se constató si las líneas de plantas regeneradas mostraban o no resistencia a la fosfinotricina.

Análisis histoquímico y molecular en líneas de plantas transformadas

Detección histoquímica

A partir del ensayo histoquímico GUS (Jefferson et al., 1987), se determinó la actividad transitoria del gen uidA. Muestras de posibles tejidos transformados y el control, se colocaron en tubos de 1.5 ml, se enjuagaron con agua desionizada estéril y se secaron en una campana al vacío.

Después se añadió 1.0 ml de acetona al 90.0% (v/v) y se colocaron 15 minutos en hielo (aprox. 4.0 °C). Se lavaron tres veces con una solución tampón de fosfato de sodio 0.1 M, se colocaron en tubos con la solución de X-Gluc (Jefferson et al., 1987) y luego en una cámara de infiltración (Bioblock, Inglaterra) con una bomba de vacío (Thomas®, EUA) 15 minutos a una presión de 84 659.7 pascales (Pa), seguido de una represurización. Finalmente se incubaron 24 horas a 37.0±1.0 °C en la oscuridad. Al concluir se lavaron con la solución tampón y se colocaron en etanol 70% (v/v).

La solución con la sal de ciclohexilamonio del ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucuronídeo (X-Gluc), se preparó con el tampón fosfato de sodio (Na3PO4, pH 7.0) 100 mM, EDTA 10 mM, ferrocianuro de potasio K4Fe(CN)6 0.1 M, ferricianuro de potasio K3Fe(CN)6 0.1 M, sustrato X-Gluc 100 mM (Duchefa, Holanda), dimetil sulfóxido 1.5% y Tritón ® X-100 1.0% (v/v). La expresión transitoria del gen uidA se determinó mediante evaluación visual al microscopio óptico.

Análisis molecular mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Para confirmar la transformación genética de las líneas de plantas in vitro regeneradas, se realizó la extracción del ADN genómico, según el procedimiento de Rojas et al. (2014). Los fragmentos de hojas (0.3 cm2) de plantas transformadas y no transformadas se sumergieron en 50 μl de la solución tampón A (100 mM NaOH; 2.0% Tween-20) y se incubaron a 95 °C, diez minutos. Se añadió 50 μl de la solución tampón B (150 mM Tris-HCl pH 2.0; 2.0 mM EDTA), y se mezclaron moderadamente hasta homogenizar los tampones.

La reacción de amplificación se realizó en un volumen total de 20 μl que contenía 2.0 μl de una mezcla con el ADN genómico, 200 μM dNTPs, 0.4 μM de cada cebador (directo y reverso), 1.0 U de la enzima polimerasa Dream Taq (5 U μl-1) (Fermentas, Alemania), 1.0% BSA (m/v), 1.0% PVP 44 000 (m/v) y 1x del tampón Green Buffer. Como control positivo se utilizó 1.0 μl del plasmidio pCAMBIA3301, control negativo ADN genómico de plantas sin transformar y un marcador molecular GeneRuler™ DNA Ladder Mix (Fermentas, Alemania). Para amplificar los fragmentos de los genes bar y uidA, se usaron cebadores con las secuencias (Tabla 1).

Tabla 1. Cebadores utilizados en la detección por PCR de los genes bar y uidA.

El PCR se realizó en el termociclador Mastercycler (Eppendorf®, Alemania). El programa para amplificar el gen bar, comenzó con cuatro minutos de desnaturalización a 95 °C, 35 ciclos de amplificación, 45 segundos a 95 °C, un minuto a 65 °C de hibridación, un minuto a 72 °C de extensión. Al concluir se añadió un paso final de extensión a 72 °C por 10 minutos. Para el fragmento del gen uidA, se siguió una secuencia similar excepto la temperatura de hibridación a 68 °C.

Los fragmentos amplificados se corrieron mediante electroforesis a 100 Volt, durante 45 minutos en gel de agarosa 1.5% (m/v) en el tampón de corrida TBE 1x (100 mM Tris-HCl, 83.0 mM ácido bórico, 1.0 mM EDTA, pH=8.0).

El gel se tiñó en una solución de bromuro de etidio a 0.5 μg ml-1 (Green y Sambrook, 2012) y fue visualizado en un transiluminador de luz ultravioleta (MacroVue, Alemania).

La eficiencia de transformación genética expresada en porciento (%), se determinó a partir del número de plantas regeneradas que mostraron resistencia a la fosfinotricina y positivas al PCR, entre el número de embriones somáticos inoculados.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Con el empleo de la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens fue posible la transformación genética de embriones somáticos de soya cultivar cubano Incasoy-27, lo que se demostró mediante procedimientos histoquímicos y moleculares.

Las plantas in vitro obtenidas a partir de embriones somáticos no transformados, mantuvieron las características morfológicas típicas de la especie (Figura 2 A). Sin embargo, las regeneradas a partir de embriones somáticos que mostraron resistencia a la fosfinotricina 6.0 mg l-1, se caracterizaron por tener un crecimiento más lento con respecto a los controles in vitro no transformados y los embriones tuvieron una germinación completa (Figura 2 C, D, E).

Después de siete días las hojas sin tratar con fosfinotricina mantuvieron el color verde excepto en los bordes donde se realizaron los cortes. Sin embargo, cuando los fragmentos de hojas fueron colocados en diferentes concentraciones de fosfinotricina, se encontró que existía clorosis en las hojas debido al efecto tóxico del herbicida, y causó la muerte en la totalidad del tejido en la mayor concentración evaluada (Figura 2 F). Por el contrario, en las hojas de las líneas regeneradas no se encontraron daños visibles de toxicidad por el herbicida (Figura 2 G).

Figura 2. Selección in vitro de plantas regeneradas a partir de embriones somáticos supuestamente transformados de Glycine max cultivar Incasoy-27. (A) Planta no transformada. (B) Multiplicación de embriones somáticos en medio de cultivo de selección con 6.0 mg l-1 de fosfinotricina. (C, D, E) Líneas de plantas regeneradas supuestamente transformadas. (F) Ensayo in vitro con fragmentos de hojas de plantas no transformadas en medio de cultivo agar-agua y diferentes concentraciones de fosfinotricina. (G) Selección in vitro de líneas regeneradas en medio de cultivo agar-agua y fosfinotricina 6.0 mg l-1 a los siete días. (1, 2) Líneas con resistencia a fosfinotricina, (c) controles no transformados. Barra= 1.0 cm

El retardo en el crecimiento en las líneas regeneradas pudo estar dado por el efecto del estrés que se produce por la interacción del tejido vegetal con la bacteria durante la infección y regeneración de plantas. En este sentido, Olhoft et al. (2003) plantearon que el empleo de la fosfinotricina (1.33 a 5.0 mg l-1) pero en nudo cotiledonal, inhibió la elongación de la mayoría de los brotes transformados en la variedad Bert. Según estos autores con este agente selectivo, la elongación de los brotes ocurrió entre 6 y 12 meses después del cocultivo, mientras que con higromicina requerían de 2 a 6 meses.

Al colocar las hojas de las plantas en el medio de cultivo de selección con la fosfinotricina, permitió diferenciar las plantas que mostraban resistencia de los controles no transformados. Un ensayo similar fue realizado por Dang y Wei (2007), pero con la diferencia que con ayuda de un pincel le aplicaron una solución de 200 mg l-1 de fosfinotricina a las plantas. A los diez días realizaron la evaluación y encontraron un cambio de color en las hojas de las plantas control producto al efecto tóxico del herbicida, el cual no fue visible en las líneas de plantas transgénicas.

Posteriormente, se demostró, además, que las plantas obtenidas de embriones somáticos de soya cultivar Incasoy-27 posibles transformados, contenían los genes bar y uidA. Se encontró expresión estable del gen uidA, aunque con diferencias en la intensidad de la expresión GUS, lo cual no fue encontrado en las plantas controles. En la línea uno, se evidenció una mayor actividad GUS en toda la superficie de la hoja; mientras que en la línea dos, fue menos intensa con manchas aisladas en ambos meristemos de la hoja. Desafortunadamente no pudo ser evaluada la expresión GUS en la línea tres (Figura 3).

Figura 3. Expresión estable del gen uidA en hojas de plantas in vitro de Glycine max cultivar Incasoy-27. (A) Control negativo; (B) Línea 1; (C) Línea 2. Barra= 0.5 cm.

En el presente experimento, el empleo del gen uidA con el promotor constitutivo CaMV35S permitió demostrar que la tinción GUS fue debido a su expresión en el tejido vegetal y no por contaminación con Agrobacterium tumefaciens. Esto fue confirmado mediante el análisis molecular de reacción en cadena de la polimerasa.

Los fragmentos amplificados contenían las bandas de 402 y 400 pb referentes a los genes bar y uidA en las líneas regeneradas uno y dos. Estas bandas fueron iguales a las encontradas en el control positivo referido al plasmidio (pCAMBIA3301) y no se encontraron en los controles de plantas no transformadas, lo que indica que no hubo contaminación en el proceso de manipulación del ADN genómico. En un análisis posterior en la línea tres se encontró la banda referente al gen uidA y no fue visible la banda del gen bar (Figura 4).

Figura 4. Electroforesis con productos amplificados en plantas de Glycine max cultivar Incasoy-27. Amplificación de fragmentos del gen bar (A) y el gen uid A (B) en las líneas uno y dos. (C) Amplificación de fragmentos de 400 pb del gen uidA en las líneas uno y tres. Las flechas indican bandas de 500 pb. Leyenda: (1+, 2+, 3+) productos de PCR de muestras de ADN de las líneas transformadas, (N) control negativo de planta no transformada, (P) control positivo con ADN plasmídico de pCAMBIA3301; (H2>O) agua estéril control negativo, (M) marcador molecular.

Los investigadores De Bondt et al. (1994), hicieron referencia a que la expresión transitoria depende de la adquisición del ADN-T, mientras que la expresión estable, depende de la integración funcional del ADN-T en el genoma del hospedero. Según este planteamiento, los resultados obtenidos demuestran que el gen bar, fue transferido e integrado de manera funcional en el genoma de las líneas regeneradas, siendo posible obtener plantas transgénicas vía Agrobacterium tumefaciens a partir de embriones somáticos de soya cultivar Incasoy-27. La baja eficiencia alcanzada en la transformación genética del cultivar cubano de soya ‘Incasoy-27’ (Tabla 2), se corresponde con lo descrito en la literatura científica, tanto para la transformación genética de cotiledones y embriones somáticos vía A. tumefaciens, y con el uso de la biobalística en embriones somáticos (Mariashibu et al., 2013).

Tabla 2. Eficiencia en la transformación genética de plantas mediada por Agrobacterium tumefaciens en soya cultivar Incasoy-27.

Se plantea que un tiempo prolongado de cultivo de los embriones somáticos utilizados en la transformación genética, pudiera influir en la eficiencia de transformación genética y regeneración de plantas completas (Hazel et al., 1998).

En relación con esto, Wiebke-Strohm et al. (2011) evaluaron diferentes plasmidios en variedades brasileñas de soya, pero combinaron la biobalística con el A. tumefaciens, y obtuvieron un 2.0% de eficiencia de transformación a partir de 1 225 embriones somáticos en la variedad Bragg, 5.2% de 96 embriones somáticos en la variedad Vencedora, y 12.0% en la variedad IAS5 con empleo de 4 924 embriones somáticos transformados. En otros trabajos, pero con empleo de cotiledones inmaduros, Ko et al. (2003) encontraron en tres experimentos de transformación genética con A. tumefaciens cada uno con 225 a 267 cotiledones de la variedad Jack, entre tres y cuatro plantas por experimento, para una eficiencia de transformación entre 1.1 a 1.7%. Por ello, disponer de una metodología para obtener plantas genéticamente modificadas es un desafío en la mayoría de las variedades de soya, debido a diferencias en la respuesta en el cultivo in vitro, que junto a la incompatibilidad con las cepas de Agrobacterium tumefaciens y las diferencias en los procedimientos empleados, han resultado en una baja eficiencia de transformación.

 

CONCLUSIONES

A partir de embriones somáticos de soya cultivar Incasoy-27 transformados con Agrobacterium tumefaciens es posible seleccionar in vitro líneas transgénicas. Se demostró mediante análisis histoquímico y molecular, la integración y expresión de los genes uidA y bar en el genoma de las plantas transformadas con 0.30% de eficiencia. Los resultados de este trabajo se alcanzan por primera vez con este cultivar y cepa de Agrobacterium tumefaciens.

 

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo formó parte de las investigaciones realizadas en la Tesis para optar por el grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas titulada: Embriogénesis somática en soya Glycine max (L.) Merrill cultivar ‘Incasoy-27’ y su aplicación en la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens. Las investigaciones se realizaron en el marco del Programa de Doctorado Curricular Colaborativo en Biotecnología Vegetal del Instituto de Biotecnología de las Plantas de la Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Esta Tesis fue defendida en el Tribunal de Ciencias Agrícolas- Fitotecnia de la República de Cuba.

Conflicto de interés

Los autores no declaran conflictos de intereses

Contribución de los autores

Conceptualización JPP, LGR y NV, Análisis formal JPP, LGR y NV, Investigación JPP, LGR, NV, LER, Metodología JPP, LGR, NV, LER, Escritura-Primera redacción JPP, Escritura-Revisión y Edición JPP,LGR y NV.

 

REFERENCIAS

Dang W, Wei Z (2007) An optimized Agrobacterium-mediated transformation for soybean for expression of binary insect resistance genes. Plant Science 173(4): 381-389

De Bondt A, Eggermont K, Druart P, Vil M, Goderis I, Vanderleyden J, Broekaert WF (1994) Agrobacterium-mediated transformation of apple (Malus x domestica Borkh.) an assessment of factors affecting gene transfer efficiency during early transformation steps. Plant Cell Reports 13(10): 587-593

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Plant cell cultures. I. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research 50 (1): 151-158

Green MR, Sambrook J (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York

Hada A, Krishnan V, Mohamed MS, Kumari A, Jolly M, Praveen S, Sachdev A (2018) Improved Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of soybean Glycine max (L.) Merr. following optimization of culture conditions and mechanical techniques. In Vitro Cell Dev Biol - Plant 54: 672-688; doi:10.1007/s11627-018-9944-8

Hazel CB, Klein TM, Anis M, Wilde HD, Parrott WA (1998) Growth characteristics and transformability of soybean embryogenic cultures. Plant Cell Reports 17(10): 765-772

Hood EE, Gelvin SB, Melehers LS, Hoekema A (1993) New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Research 2(4): 208-218

Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987) GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. The EMBO Journal 6(13): 3901-3907

Ko TS, Lee S, Krasnyanski S, Korban SS (2003) Two critical factors are required for efficient transformation of multiple soybean cultivars: Agrobacterium strain and orientation of immature cotyledonary explant. Theoretical and Applied Genetics 107(3): 439-447

Kumari S, Krishnan V, Dahuja A, Vinutha T, Jolly M, Sachdev A (2016) A rapid method for optimization of Agrobacterium-mediated transformation of Indian soybean genotypes. Indian J Biochem Biophys 53: 218–226

Mangena P, Mokwala P, Vassileva R (2017) Challenges of in vitro and in vivo Agrobacterium mediated genetic transformation in soybean. En: Minobu K (Ed). Soybean-The Basis of Yield, Biomass and Productivity, pp. 75-94. IntechOpen, Zagreb

Mariashibu T, Anbazhagan R, Shu J, Ganapathi A, Ramachandran S (2013) In vitro regeneration and genetic transformation of soybean: Current status and future prospects. En: Board JE (Ed). A Comprehensive Survey of International Soybean Research—Genetics, Physiology, Agronomy and Nitrogen relationships, pp. 413-446. InTechOpen, Croatia

Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3): 473–497

Olhoft PM, Flagel LE, Donovan CM, Somers DA (2003) Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method. Journal Plant Biotechnology 216(5): 723-735

Pareddy D, Chennareddy S, Anthony G, Sardesai N, Mall T, Minnicks T, Karpova O, Clark L, Griffin D, Bishop B, Shumway N, Samuel P, Smith K, Sarria R (2020) Improved soybean transformation for efficient and high throughput transgenic production. Transgenic Res 29: 267-281; doi:10.1007/s11248-020-00198-8

Pérez J (2016) Embriogénesis somática en soya Glycine max (L.) Merrill cultivar Incasoy-27 y su aplicación en la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens. Tesis para optar por el grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas, Instituto de Biotecnología de las Plantas Universidad Central Marta Abreu de las Villas, Santa Clara, Cuba

Pérez JL, Blanco TS, García L, Veitía N, Bermúdez I, Collado R, Torres D, Romero C (2012) Influencia del tipo e intensidad de luz en la formación y multiplicación de embriones somáticos de soya. Revista Colombiana de Biotecnología 14(2): 139-146

Pérez J, García L, Veitía N, Bermúdez I, Collado R, Torres D, Romero C, Ramos A (2014) Sensibilidad al herbicida Glufosinato de amonio en plantas de soya cultivar Incasoy-27. Centro Agrícola 41(4): 63-67

Pérez J, García LR, Veitía N, Bermúdez I, Collado R (2015) Determinación de la concentración mínima inhibitoria de Glufosinato de amonio para seleccionar embriones somáticos transformados de soya cultivar Incasoy-27. Cultivos Tropicales 36(3): 58-63

Pérez J, García LR, Veitía N, Bermúdez I, Collado R, Torres D (2017) Efecto de la morfología de los embriones somáticos en la regeneración de plantas de soya (Glycine max L. Merrill). Cultivos Tropicales 38(2): 28-35

Pérez J, García LR, Veitía N, Bermúdez-Caraballoso I, Collado R, Roque (2019) Influencia de maltosa y sacarosa en la maduración de embriones somáticos de Glycine max cv. ‘Incasoy-27’. Biotecnología Vegetal 19(1): 35-42

Ponce M, de la Fé C, Ortiz R, Moya C (2003) Informe de nuevas variedades, INCASOY-24 e INCASOY-27: Nuevas variedades de soya para las condiciones climáticas de Cuba. Cultivos Tropicales 24(3): 49

Rao SS, Mamadou L, Mcconnell M, Polisetty R, Kwanyuen P, Hildebrand DF (2009) Non-antibiotic selection systems for soybean somatic embryos: the lysine analog aminoethyl-cysteine as a selection agent. BMC Biotechnology 9(1): 94

RNBA (2020) Resultados experimentales de la Red Nacional de Biotecnoloía Agrícola, una experiencia exitosa de articulación público-privada en investigación. Revista INIA (60): 87-91

Rojas LE, Reyes M, Pérez N, Olóriz MI, Posada L, Ocaña B, Portal O, Chong B, Pérez JL (2014) Extracción in situ de ADN genómico para el análisis por PCR de regiones de interés en cuatro especies vegetales y un hongo filamentoso. Biotecnología Vegetal 14 (3): 151-154

Thompson C, Movva R, Tizard R, Crameri R, Davies J, Lauwereys M, Bottermann J (1987) Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal 6(9): 2519-2523

Tougou M, Yamaghisi N, Furutani N, Kaku K, Shimizu T, Takahata Y, Sakai J, Kanematsu S, Hidaka S (2009) The application of the mutated acetolactate synthase gene from rice as the selectable marker gene in production of transgenic soybean. Plant Cell Reports 28(5): 769-776

Wiebke-Strohm B, Droste A, Pasquali G, Borges M, Bücker-Neto L, Pereira LM, Bencke M, Schenkel M, Margis-Pinheiro M, Bonadese-Zanettini ME (2011) Transgenic fertile soybean plants derived from somatic embryos transformed via the combined DNA-free particle bombardment and Agrobacterium system. Euphytica 177(3): 343-354

 

 

Recibido: 13-10-2020

Aceptado: 23-12-2020



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