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RESEÑA BIBLIOGRÁFICA

 

 

Factores que influyen en la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens en Phaseolus vulgaris L.

 

Factors affecting genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens in Phaseolus vulgaris L.

 

 

Amanda Martirena-Ramírez, Novisel Veitía.

Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: amanda@ibp.co.cu

 

 

RESUMEN

El género Phaseolus, así como otras leguminosas, se ha mostrado recalcitrante a la regeneración de plantas in vitro y a la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens. La transferencia de genes en esta especie es limitada debido a su condición genotipo dependiente, además de resultar un proceso de baja eficiencia y poco reproducible. Existen evidencias que varios factores influyen en la integración del ADN y la transformación estable de plantas. Esta revisión tuvo como objetivo analizar la influencia de diferentes factores en la eficiencia de la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens en Phaseolus vulgaris L. tales como: cepa bacteriana, plasmidio, temperatura, condiciones de iluminación, tiempo de cocultivo, concentración bacteriana y marcador de selección.

Palabras clave: ADN, frijol común, leguminosas, plantas transgénicas.

ABSTRACT

Phaseolus genus, as well as other legumes, has proved recalcitrant plant regeneration in vitro and mainly to genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens. Genetic transformation in this species is limited because of their genotype dependent, as well as being a process of low efficiency and poor reproducibility. There are evidences that several factors influence DNA integration and stable transformation of plants. This review aims to analyze the influence of different factors on the efficiency of genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens in Phaseolus such as: bacterial strain, plasmid, temperature, lighting conditions, coculture time, bacterial concentration and selection marker.


Keywords: common beans, DNA, legumes, transgenic plants.

 

 

CONTENIDO
INTRODUCCIÓN
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA VÍA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA EFICIENCIA DE LA TRANSFORMACIÓN
Cepa de Agrobacterium y plasmidio
Temperatura
Condiciones de iluminación
Concentración bacteriana y tiempo de cocultivo
Genes marcadores de selección
CONCLUSIONES

 

INTRODUCCIÓN

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es uno de los cultivos más comercializados y al que se dedica una gran parte del área productiva del planeta. El elevado contenido de proteínas y lípidos de su grano lo convierten en uno de los cultivos de mayor interés para la alimentación humana (Amugune et al., 2011).

En Cuba, el frijol ha sido cultivado tradicionalmente y se encuentra entre los cultivos económicos más importantes, no solamente por su alto valor nutricional, sino por el hábito de consumo por la población. Sin embargo, su producción se ha visto afectada por factores bióticos y abióticos. Los primeros incluyen: plagas, enfermedades y malezas y los segundos: calor, sequía, suelos ácidos, baja fertilidad del suelo y salinidad (Velcheva et al., 2005). Por tales razones, es de gran interés el desarrollo de nuevos cultivares con características agronómicas mejoradas.

El mejoramiento genético tradicional se basa en la variabilidad genética natural y la reproducción sexual. La variabilidad en Phaseolus vulgaris se ve restringida debido al ligamiento genético y a las barreras de hibridación sexual. La transformación genética ha logrado eliminar la incompatibilidad sexual existente entre los individuos, permitiendo la transferencia de genes entre organismos genéticamente distantes (Kwapata et al., 2010). Sin embargo, la transformación genética en el frijol común ha estado limitada por la inexistencia de protocolos eficientes y reproducibles (Angenon y Thu, 2011).

Los elementos básicos necesarios para la aplicación con éxito de métodos de transferencia de genes en el mejoramiento genético de los cultivos son cuatro: 1) establecimiento de un sistema de cultivo de tejidos eficiente y reproducible para regenerar plantas completas y fértiles, 2) contar con vectores apropiados, tanto para el clonaje del gen de interés y el vector para su transferencia al tejido a transformar, 3) un sistema de transferencia de genes y por último, 4) herramientas de análisis para detectar la presencia del transgén (Arellano et al., 2008; Angenon y Thu, 2011).

La transformación genética utiliza básicamente dos estrategias para realizar la transferencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) a las plantas: la primera, que emplea métodos directos como biobalística (bombardeo de partículas), tratamiento con polietilenglicol (PEG), microinyección, electroporación, utilización de láser y abrasión con fibras y una segunda que utiliza métodos indirectos mediante vectores biológicos (Hansen y Wright, 1999).

Varios autores tales como: Aragao et al. (2002), Rech et al. (2008) y Kawapata et al. (2012) describieron la transformación genética mediante el bombardeo de partículas en Phaesolus vulgaris. Sin embargo, este método tiene como desventaja un patrón de integración complejo del transgén, de este modo se incrementa la probabilidad de su silenciamiento (Yang et al., 2005). La transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens, resulta un método de mayores ventajas, ya que permite la integración de un segmento de ADN preciso, además de introducir pocas copias en el genoma de la planta (Gelvin, 2000).

Independientemente de la información disponible sobre la regeneración in vitro de Phaseolus vulgaris, la transformación genética mediante Agrobacterium tumefaciens presenta baja eficiencia, debido a que los protocolos existentes se han desarrollado en cultivares específicos, y a la escasa estandarización de parámetros para la transferencia de ADN tales como: genotipo, cepa bacteriana, plasmidio, fotoperíodo, concentración de la bacteria y el agente selectivo. Sobre la base de lo anteriormente descrito, el presente trabajo tuvo como objetivo analizar la influencia de diferentes factores en la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens en Phaseolus vulgaris.

TRANSFORMACION GENETICA VÍA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

La transformación genética consiste en incorporar y expresar de manera estable, genes foráneos en el genoma de la planta, pero en este caso por métodos distintos a la fusión de gametos u otras células sin alterar su genotipo y fenotipo (Gelvin et al., 2003a). Un factor crítico en la ransformación genética es la selección de las células transformadas, ya que los genes introducidos serán incorporados solo en una fracción de las células expuestas a la transformación. La selección se realiza con la ayuda de genes marcadores de selección que confieren resistencia a agentes químicos, tales como antibióticos, herbicidas, análogos de aminoácidos o azúcares (Opabode, 2006).

En los métodos biológicos o de transferencia indirecta de ADN, se utilizan cepas de A. tumefaciens o A. rhizogenes como vectores, para aprovechar la capacidad natural de estas bacterias para introducir en las células vegetales infectadas un segmento de cadena simple de su propio ADN (Cervera et al., 1998). Este es uno de los ejemplos verificados de transferencia natural de ADN entre reinos (Ditt et al., 2001) y además constituye un ejemplo de flujo génico horizontal (Pelczar et al., 2004). El ADN es transferido, heredado y expresado de manera estable en las células receptoras (Gelvin et al., 2003b).

A. tumefaciens, es una bacteria fitopatógena Gram negativa, que habita en el suelo y que es causante de la enfermedad denominada `agalla de corona', que afecta muchas plantas dicotiledóneas (Li et al., 2002).

La naturaleza biológica única de la relación de Agrobacterium con su hospedero, y su importancia en el desarrollo de plantas transgénicas, favorece el interés por entender los mecanismos mediante los cuales estas bacterias transfieren el ADN a las células eucarióticas (Chen et al., 2002).

El plásmido Ti tiene una región (vir) donde se encuentran varios genes (virA, virB, virC, virD, virE, virG y virH) que codifican proteínas involucradas en el proceso de transferencia del ADN-T desde la bacteria hasta el núcleo de la célula vegetal (Tzfira y Citovski, 2000).

Algunos trabajos destacan el papel de los genes vir en funciones relacionadas con el proceso de integración y expresión del ADN-T en el genoma de la célula vegetal (Tzfira et al., 2003). Otros autores han descrito el papel que juegan los sitios específicos de inserción de los transgenes en el genoma de las plantas (Tzfira et al., 2004) o la participación de los genes de la propia planta en el proceso de transformación genética con Agrobacterium (Li et al., 2005).

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA TRANSFORMACIÓN GENÉTICA CON AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Cepa de Agrobacterium y plasmidio

La fase inicial del desarrollo de un protocolo de transformación consiste en la búsqueda de las cepas de Agrobacterium compatibles y el incremento de la eficiencia de transformación (Jefferson et al., 1987). La cepa de Agrobacterium tumefaciens utilizada en la transferencia de ADN puede influir significativamente en la eficiencia de la transformación genética. La virulencia, así como las diferencias estructurales y organizacionales del ADN-T y los genes vir pueden ser distintos entre una cepa y otra lo que afectaría su capacidad de infección (Grant et al., 2003).

En varias investigaciones, el frijol común se ha encontrado que es susceptible a diferentes cepas de Agrobacterium. En este sentido, Zhang et al. (1997) describieron una interacción no significativa entre las cepas de Agrobacterium tumefaciens (A2760 y la EHA105) y 11 genotipos de frijol común. Sin embargo, independientemente del genotipo, la cepa A2760 produjo mayor expresión GUS en los cotiledones inoculados.

Por su parte, Guidolin (2003), evaluaron cuatro cepas de A. tumefaciens (GV3101, EHA 105, LBA4404, GV2260) todas con el plasmidio pBECKS20004 y la cepa LBA4404 con el plasmidio pTOK233. Los callos del cultivar de Phaseolus vulgaris `Xan 159' inoculados con la cepa LBA4404 con el plasmidio pTOK233 tuvieron una mayor expresión GUS que con las restantes combinaciones evaluadas. Este autor refirió la importancia de la combinación de la cepa con el plasmidio binario a ser utilizado y relacionó esta respuesta con la presencia de genes de virulencia (virB, virG; virC) y con la expresión constitutiva del plasmidio binario derivado del plasmidio Ti `supervirulento' pTiBo542 (Jin et al., 1987). En correspondencia con estos resultados Amugune et al. (2011) al evaluar las cepas de A. tumefaciens (LBA4404 y EHA 105), en la transformación genética de P. vulgaris, solamente encontraron expresión GUS con la cepa LBA4404. Estos autores refirieron que quizás la cepa EHA 105 no sería factible en la transformación genética de esta especie. Por el contrario, Mukeshimana et al. (2013) emplearon las cepas GV3101, LBA4404 y EHA105 lograron una mayor expresión GUS con la cepa GV3101, seguido de EHA105 y por último LBA4404. Estos autores atribuyeron estos resultados a la susceptibilidad del frijol común al tipo de nopalina presente en esta cepa de Agrobacterium tumefaciens. De igual manera, Collado (2013) alcanzó los mayores valores de área del callo cubierta por la tinción con la cepa EHA 105 en P. vulgaris cultivar `CIAP7247F'.

Las variaciones en la respuesta en P. vulgaris ante diferentes cepas de A. tumefaciens y plasmidios, se ha descrito por varios autores (Mc Clean et al., 2002; Mukeshimana et al., 2013). De forma general, se asocia dicha respuesta a la probabilidad de aparición de diferentes números de genes de resistencia en el hospedero susceptible. Es por ello, que se requiere al iniciar los estudios de transformación genética evaluar varias cepas de Agrobacterium tumefaciens y plamidios para lograr la integración de los genes de interés en el genoma de la planta. No obstante, estos no son los únicos factores que inciden en la eficiencia del proceso.

Temperatura

El efecto de la temperatura sobre la inserción del ADN-T fue primeramente descrito en especies de plantas dicotiledóneas. Sin embargo, en Phaseolus vulgaris no se ha evaluado de manera sistemática. Los trabajos realizados en transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens en esta especie (Liu et al., 2005; Amugune et al., 2011; Mukeshimana et al., 2013) utilizaron temperaturas entre 25 y 280C, respectivamente. Este rango de temperaturas se basa en los estudios realizados por Dillen et al. (1997) y De Clercq et al. (2002) los cuales evaluaron el efecto de este factor en la transformación genética de Phaseolus acutifolius. Dichos autores plantearon que la movilización del plasmidio mediado por los genes vir en el mecanismo de transferencia del ADN-T a la planta, es altamente dependiente de la temperatura y se ha descrito para los genes vir B-vir D4 que intervienen en el aparato de transferencia. Además, sugirieron un rango de temperatura de 20 a 25oC ya que fue donde se produjo una mayor expresión de los genes vir D2 y vir G y la inducción del gen vir B y este coincidió con el óptimo para la expresión del gen gus y la formación del tumor. Según lo anteriormente expresado se debe considerar el factor temperatura en los ensayos de transformación genética, ya que permite incrementar la eficiencia de transformación.

Condiciones de iluminación

Las condiciones de iluminación durante el cocultivo varían considerablemente en diferentes procesos de transformación. Por ejemplo, en Phaseolus acutifolius A. Gray, Zambre et al. (2003) plantearon que el efecto promotor de la luz en la transferencia de ADN probablemente no es mediado por un aumento de los inductores de los genes vir. Dichos autores señalaron tres razones en relación con esto: los explantes fueron dañados, lo cual libera los inductores del gen vir, las bacterias fueron pre-inducidas con acetociringona antes del cocutivo y los medios de cocultivo fueron optimizados para la inducción del gen vir en relación con el pH y la concentración de monosacáridos y acetosiringona. Además, refirieron que con mayor probabilidad las frecuencias de transferencia de ADN-T son influidas por la luz, no al nivel de la bacteria, sino desde el punto de vista fisiológico, a través de la competencia de las células de la planta por la fijación de Agrobacterium o la toma del ADN-T.

Diferentes condiciones de iluminación pueden afectar factores fisiológicos que a su vez influyen en la competencia por la transferencia de ADN-T e incluyen: el nivel de hormonas de la planta, la proliferación celular y el estadio del ciclo celular (Villemont et al., 1997). En correspondencia con esto, De Clercq et al. (2002) obtuvieron los mejores resultados en la transformación genética vía A. tumefaciens en callos de Phaseolus acutifolius con un fotoperíodo de 16/8 h luz/oscuridad, mientras que en la oscuridad constante se presentaron los menores grados de expresión GUS.

En la literatura científica generalmente se asocia el tipo de explante con las condiciones de iluminación en la etapa del cocultivo. Por ejemplo, Zambre et al. (2003) utilizaron callos de Phaseolus acutifolius y segmentos de raíz de Arabidopsis thaliana en cocultivo con Agrobacterium tumefaciens con diferentes condiciones de iluminación como: oscuridad constante, fotoperíodo 16-8h luz/ oscuridad y luz continua y concluyeron que la transferencia del ADN estuvo altamente correlacionada con el período de luz, siendo mayor la actividad gus transitoria cuando se utilizó luz continua y lo relacionaron con los dos tipos de explantes utilizados. Por su parte Collado (2013) evaluó dos condiciones de iluminación 16-8h luz/ oscuridad y oscuridad constante y alcanzó los mayores grados de expresión gus transitoria con 16-8h luz/ oscuridad en callos organogénicos de P. vulgaris cultivar `CIAP7247F'. teniendo en cuenta estos elementos en los sistemas de transformación genética de P. vulgaris, el factor iluminación debe ser evaluado teniendo en cuenta el tipo de explante y el cultivar.

Concentración bacteriana y el tiempo de cocultivo

La concentración óptima de células de A. tumefaciens, es un parámetro importante a tener en cuenta en cualquier protocolo de transformación, puesto que concentraciones pequeñas pueden tener por resultado la reducción de la transferencia de ADN, mientras que concentraciones más altas pueden causar la muerte del explante blanco. Ello depende de la cepa de Agrobacterium y del tejido de planta utilizado (Gurlitz et al., 1987). Para la transformación genética tanto en P. vulgaris como P. acutifolius se han descrito diferentes tiempos de cocultivo y concentraciones de células bacterianas.

Por ejemplo, en P. acutifolius, Zhang et al. (1997) ajustaron la concentración de células a DO600=0.8-1.0 con tres días de cocultivo, De Clercq et al. (2002) a DO600=0.8 con dos días de cocultivo y Zambre et al. (2005) refirieron el ajuste de la suspensión bacteriana a una DO600=0.05 y el cocultivo por siete días.

Sin embargo, en P. vulgaris se han referido menores valores de DO600 y tiempo de cocultivo por por Lui et al. (2005) cuando realizaron la transformación genética con el empleo de la sonicación y la infiltración al vacío como tratamientos al explante blanco (DO600=0.5-0.6 y 24 horas de tiempo de cocultivo). Por otra parte, Amugune et al. (2011) utilizaron de tres a cuatro días de cocultivo, Mukeshimana et al. (2013) informaron el uso de A. tumefaciens crecido hasta DO600= 0.5 y ocho días de cocultivo y Collado (2013) utilizó una suspensión bacteriana ajustada a DO600= 0.05-0.5 y de tres a seis días de cocultivo. Estos autores alcanzaron los mayores valores en el área del callo con expresión GUS cuando emplearon una DO600=0.5 y seis días de cocultivo. Lo descrito anteriormente puede estar relacionado con la naturaleza recalcitrante de P. vulgaris, por lo que altas densidades de células de Agrobacterium son necesarias para incrementar la eficiencia del proceso de transformación. De forma general,
en P. vulgaris periodos de cocultivo prolongados favorecen la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens.

Genes marcadores de selección

Los genes de resistencia a antibióticos y herbicidas han sido ampliamente usados para la selección en leguminosas transformadas genéticamente (Miki et al., 2009).

Estos genes marcadores de selección codifican proteínas con actividades enzimáticas que confieren resistencia a las células transformadas a un determinado sustrato, lo que permite que estas se multipliquen en presencia del agente selectivo (Hadi et al., 2002). Un gen marcador ideal debe ser capaz de expresarse en cualquier célula o tejido y en un gran número de especies vegetales. La forma más común de seleccionar dos tejidos transformados es la indirecta, basada en un gen adicional, el cual confiere ventajas selectivas en condiciones específicas. Una excepción es la resistencia a herbicidas. En este caso se puede seleccionar directamente las células, tejidos o plantas transformadas a partir de genes de interés agronómico (Sreeramanan et al., 2006).

La utilización concomitante de dos tipos de genes marcadores es común. Normalmente utilizar los genes que confieren resistencia a antibióticos o a herbicidas, conjuntamente con genes, cuyo grado de expresión puede ser visualizado por técnicas de espectrofotometría o por ensayos histoquímicos.

Los genes marcadores más comúnmente usados son el gen que codifica para la neomicina fosfotransferasa (npt II), el de higromicina fosfotransferasa (hpt), los genes de resistencia a herbicidas bar y pat (que codifican para fosfinotricina acetil transferasa) y que confiere resistencia a biolaphos, fosfinotricina o glufosinato de amonio (Miki et al., 2009).

La utilización de uno u otro marcador de selección en experimentos de transformación genética de Phaseolus vulgaris requiere que se determinen las concentraciones adecuadas del agente selectivo y su efecto inhibitorio en el crecimiento de los explantes utilizados en el proceso de transformación genética (Bermúdez et al., 2007). En P. acutifolius, Zambre et al. (2005) realizaron la selección en diferentes explantes de dos cultivares con el marcador de selección geneticina G-418 y determinaron que la mínima concentración inhibitoria de este antibiótico para el eje embriogénico fue de 5 mgl-1 y para el caso de los callos nodulares verdes inhibió totalmente la proliferación de estos en el cultivar `TB1' a 20 mgl-1 y a 15 mgl-1 para el cultivar `PI440795'. Estos autores plantearon que la reducción de la presión de selección es un factor que puede mejorar el procedimiento de transformación.

Por su parte, Bermúdez-Caraballoso et al. (2007) realizaron la selección en yemas múltiples de P. vulgaris cultivar `CIAP 7247F' con 50 mgl-1 de geneticina y 20 mgl-1 de higromicina-B, ya que estas concentraciones provocaron necrosis y muerte total de los explantes.

En otros estudios, Amugune et al. (2011) utilizaron 50 mgl-1 de kanamicina e higromicina-B, respectivamente. De igual forma, Mukeshimana et al. (2013) emplearon 50 mgl-1 de geneticina (npt II) para la selección en eje embrionario, segmentos de tallo y explantes de hojas en P. vulgaris. La presencia de este gen en la construcción genética utilizada en los experimentos de transformación le confiere a los tejidos transformados la resistencia a antibióticos aminoglicósidos por fosforilación de un grupo hidroxil específico de este (Screemanan et al., 2006).

Otros autores como Collado (2013) han empleado glufosinato de amonio como agente selectivo en callos organogénicos de Phaseolus vulgaris cv. `CIAP7247F' y seleccionaron 0.50 mgl-1 como la concentración mínima inhibitoria, ya que más del 87% de los callos murieron a las ocho semanas de cultivo.

La transferencia de ADN está críticamente influenciada por: la cepa de Agrobacterium, condiciones de iluminación, concentración bacteriana, tiempo de cocultivo y los genes marcadores de selección. Existen otros factores que inciden en la transformación genética tales como: el tejido blanco, el sistema de regeneración, los tratamientos
físicos al explante, así como la estrategia de selección.

Los avances más recientes en la transformación genética en P. vulgaris forman parte del Programa de mejoramiento genético del cultivo que se desarrolla en el Instituto de Biotecnología de las Plantas de la Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. En este sentido, se ha desarrollado un protocolo de regeneración in vitro vía organogénesis indirecta en el que se incrementó la eficiencia de regeneración in vitro así como la transformación genética. Lo anterior ha sido probado en cuatro cultivares de P. vulgaris. Sin embargo, Collado (2013) refirió que con el empleo de dicho protocolo de regeneración, en la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens, se produjeron escapes en el proceso de transformación y la presencia de plantas quiméricas. Dicho autor planteó que estos resultados fueron debidos posiblemente al origen multicelular del callo, el marcador de selección que quizás no fue el más apropiado y la estrategia de selección.

Según los resultados hasta el presente, como estrategia para la transformación genética en P. vulgaris se requiere tener en cuenta los aspectos descritos y considerar para la transformación el uso de diferentes tipos de explantes antes de formar el callo para reducir el número de escapes y de plantas quiméricas unido a la reducción del número de pasos (selección) en dicho proceso de transformación.

 

CONCLUSIONES

La literatura científica disponible demuestra que la transformación genética del frijol común no está aún bien desarrollada como en otros cultivos. Es por ello que se hace necesario el estudio de factores de gran importancia tales como: cepa bacteriana, plasmidio, temperatura, condiciones de iluminación, concentración bacteriana, tiempo de cocultivo y marcador de selección asociado al genotipo. Esto permitirá incrementar la eficiencia de la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens de Phaseolus vulgaris. Además, puede facilitar la aplicación de estos resultados a sistemas de transformación de otras leguminosas para mejorar la eficiencia de muchos de los protocolos publicados.


 

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Recibido: 3-3-2013
Aceptado: 1-4-2013

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